葡萄糖和果糖对海捕野生大黄鱼精子活力的影响

罗 芬,黄伟卿,2,李进寿,阮少江,林 婕,阮俊峰,周逢芳

( 1.宁德师范学院 生物系，福建 宁德 352100；2.宁德市鼎诚水产有限公司，福建 宁德 352100 )

大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)为我国特有的中下层暖温性近海集群洄游鱼类，主要分布于南海、东海和黄海南部，原为我国海洋四大主要捕捞对象之首[1-2]。经过30多年的养殖发展，至2015年全国大黄鱼产量达1.48×105t，年产值约120多亿元，成为我国最大规模的海水网箱养殖鱼类和八大优势出口养殖水产品之一[3]。大黄鱼养殖快速发展的同时，累代近亲繁殖导致生长性能、形态特征、抗逆性能降低等[4-6]。对大黄鱼群体进行遗传性状改良和良种选育具有现实意义，而海捕野生大黄鱼群体在遗传特性、营养结构、形态特征、抗逆性能等方面均优于养殖大黄鱼群体[7-10]。但海捕野生大黄鱼成活率低，直接作为或培育至亲本用于种质改良难度大，因此有效保存海捕野生大黄鱼的精液对保护和改良大黄鱼种质资源具有重要意义。

Gardiner[11]认为，鱼类精子具有三羧酸循环代谢能力。严安生等[12]指出，单糖在精浆中的主要作用是维持精子运动。谷巍[13]发现，高白鲑(Coregonuspeled)精子在葡萄糖或果糖溶液中激活效果较好。迄今为止，有关糖类对大黄鱼精子活力的影响研究较少，仅朱东发[14]报道过葡萄糖等环境因子对养殖大黄鱼精子的激活率和活动时间的影响，张艺等[15]在稀释液中添加0.005 mol/L葡萄糖保存精子；而在果糖中保存精子的研究未见报道。鱼类精子活力是人工授精稀释液的配制及精子低温、超低温保存的基础。笔者研究了葡萄糖和果糖剂量对大黄鱼精子活力的影响，旨在补充和丰富大黄鱼生殖生物学资料，为人工繁殖时精子稀释液和冷冻保存液的配制和大黄鱼种质资源改良提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

选取健壮、外表无损伤及病害的体长26.5～35.4 cm、体质量325～520 g的成熟海捕野生大黄鱼雄鱼7尾，每尾注射剂量为5 μg/kg的促黄体素释放激素类似物，暂养24 h后进行试验。

1.2 方法

1.2.1 精液的采集与保存

用干毛巾擦拭鱼体，吸干生殖孔周围及体表的水分，用手轻挤压腹部两侧挤出精液，用干净的胶头滴管从生殖孔吸取未受污染的精液，放小培养皿中并加盖，置冰箱4 ℃保存，定期取少许待检。经显微镜检查精子活力在90%以上者用于试验。

1.2.2 葡萄糖溶液和果糖溶液的配制

以砂滤海水配制浓度为0、100、200、300、400、500、600、700、800、900 mmol/L的葡萄糖溶液和果糖溶液。

1.2.3 精子活力的观察

采用平板载玻片法。调好10×40倍的显微镜焦距，滴一滴试验液于干燥洁净的载玻片上，用消毒的解剖针蘸取少许精液均匀涂于试验液中，精液与试验液接触的瞬间立即启动秒表计时，观察记录精子活动情况[16]。以1个视野为准，每个样品重复3～5次。

精子在水中的运动状态分为激烈运动、缓慢运动和摇尾运动3个连续阶段，这3个阶段时间的总和为总运动时间，即精子的寿命。各阶段的具体划分标准参照文献[17]。

1.2.4 数据处理

试验数据以平均值±标准差表示，用SPSS 17.0软件处理，用单因素方差分析法进行差异显著性检验。

2 结 果

2.1 葡萄糖和果糖溶液剂量对海捕野生大黄鱼精子活力的影响

葡萄糖浓度为0、100、900 mmol/L时，大黄鱼精子不运动；200～800 mmol/L时，精子被激活；200～500 mmol/L时，激烈运动、平均寿命随浓度升高而延长；500 mmol/L时激烈运动和平均寿命达最大值，分别为(172.11±7.60) s和(654.44±36.95) s；超过500 mmol/L则随浓度升高逐渐缩短；500 mmol/L葡萄糖溶液对大黄鱼精子激烈运动的影响显著高于其他浓度(P<0.05)；500 mmol/L与600 mmol/L间的平均寿命差异不显著(P>0.05)(表1)。

果糖浓度在0、100、800、900 mmol/L大黄鱼时，精子不运动；200～700 mmol/L时，精子被激活并运动；200～600 mmol/L时，激烈运动和平均寿命随浓度升高而延长；600 mmol/L时，激烈运动和平均寿命达最大值，分别为(160.78±8.80)s和(599.56±21.13) s；超过600 mmol/L时，随浓度升高明显缩短；600 mmol/L果糖溶液对大黄鱼精子活力的影响显著高于其他浓度(P<0.05)(表2)。

表1 葡萄糖溶液浓度对海捕野生大黄鱼精子活力的影响 s

注：同列中带不同上标字母的平均值间差异显著(P<0.05)，下同.

表2 果糖溶液浓度对海捕野生大黄鱼精子活力的影响 s

2.2 葡萄糖溶液和果糖溶液与海捕野生大黄鱼精子激烈运动时间的关系

大黄鱼精子在0～200 mmol/L葡萄糖溶液中无激烈运动，数学模型为y=0(0 mmol/L

果糖浓度在0～100 mmol/L和800～900 mmol/L时精子无激烈运动，数学模型y=0(0 mmol/L

葡萄糖和果糖溶液对大黄鱼精子激烈运动影响的比较表明，最适葡萄糖溶液对激烈运动时间延长的效果明显优于最适果糖溶液浓度(图1)。

2.3 葡萄糖溶液和果糖溶液与海捕野生大黄鱼精子寿命的关系

0～100 mmol/L葡萄糖溶液中精子不运动，拟合的精子寿命数学模型y=0(0 mmol/L

图1 葡萄糖和果糖溶液对海捕野生大黄鱼精子激烈运动时间的影响

0～100 mmol/L和800～900 mmol/L果糖溶液中精子不运动，数学模型为y=0(0 mmol/L

图2 葡萄糖和果糖溶液对海捕野生大黄鱼精子寿命的影响

试验结果表明，果糖溶液在浓度较高时表现出较好的延长精子寿命的作用，而葡萄糖溶液在相对较低浓度时就表现出了较好的延长效果，且葡萄糖溶液对大黄鱼精子寿命的影响普遍明显高于果糖(图2)。

3 讨 论

精、卵质量与活力决定着人工繁育中的受精率，延长激烈运动时间可提高受精率，也是考察鱼类人工繁育中精子质量的重要指标之一。体外受精鱼类中，精子在精巢或精浆中没有活力，只有排到水环境中才被激活，其活力受pH、温度、盐度、离子、糖类等因素影响[13]。如果精子在最适条件下被激活，将显著提高受精率，有助人工繁育的顺利进行，保证鱼类胚胎的质量，对种质资源的改良亦具积极的促进意义。

鱼类精子发生过程中形成的能量物质很少，体外精、卵相遇时精子入水耗费了大量能量以调节渗透压平衡，可用于维持运动的能量甚少，因此精子被激活后运动时间十分短暂。有研究表明，适当浓度的糖类可提高鲤鱼(Cyprinuscarpio)、团头鲂(Megalobramaamblycephala)、高白鲑、大鳞副泥鳅(Paramisgurnusdabryanus)、白斑狗鱼(Esoxlucius)、大弹涂鱼(Boleophthalmuspectinirostris)等鱼类精子活力[12-13,18-20]。本试验中，适当浓度的葡萄糖或果糖溶液可激活大黄鱼精子，并延长激烈运动时间和寿命，即对大黄鱼精子运动具明显促进作用，与上述研究结果相似。其原因是葡萄糖、果糖、半乳糖等是鱼类精浆的重要组成成分，参与精子代谢，维持精子活力[12]。Gardiner[11]认为，鱼类的精子是具有三羧酸循环代谢的能力，通过氧化葡萄糖、果糖等外源性碳水化合物得到能量补偿，尤其是葡萄糖、半乳糖和果糖这三种单糖是精子活动及存活可选择的能源[21]。单糖物质有效地延长了精子活动时间，精卵有更多接触机会，势必大大提高人工授精的受精率。朱冬发[14]报道，葡萄糖溶液影响养殖大黄鱼精子的活动时间，笔者关注不同浓度葡萄糖溶液对精子激烈运动和寿命的影响，因为延长激烈运动时间对受精过程中精卵的结合更具有实际意义。通过建模进一步求出最适葡萄糖浓度：527 mmol/L葡萄糖溶液中大黄鱼精子激烈运动时间最长；559 mmol/L葡萄糖溶液中大黄鱼精子寿命最长；超过该浓度精子活力逐渐下降，这可能与浓度升高导致了外界溶液渗透压过高，在运动过程中需要消耗能量调节渗透压有关。故建议人工授精时选择527～559 mmol/L葡萄糖溶液作为激活的稀释液，以提高大黄鱼精子活力，保持激烈运动时间，延长寿命，提高受精率。0～100 mmol/L和大于900 mmol/L精子无运动，因此这两个范围的葡萄糖溶液可作为大黄鱼精子保存液的参考值。

糖类作为外源营养物质对鱼类精子活力的影响多见于葡萄糖[11-15,18-21]，果糖的研究较少。谷巍等[13]关注了果糖对高白鲑精子活力影响；万全等[19]比较了葡萄糖、果糖等5种糖类对大鳞副泥鳅精子的保存效果，认为不同糖类保存精子的效果不同，保存效果由高到低依次是：葡萄糖>蔗糖>L-山梨糖>D-果糖>D-木糖。本试验首次关注果糖溶液对大黄鱼精子活力的影响，且通过数学建模求出最适果糖浓度为614 mmol/L，大黄鱼精子的激烈运动时间最长；597 mmol/L果糖液大黄鱼精子的寿命最长。由此建议人工授精时可选择浓度为597～614 mmol/L的果糖溶液作为激活的稀释液，以延长精子寿命，保持精子激烈运动时间，提高受精率。果糖浓度在0～100 mmol/L和800 mmol/L之后时，精子无运动能力，这两个浓度可作为大黄鱼精子保存液的参考值。

虽然果糖和葡萄糖都是单糖，但对海捕野生大黄鱼精子活力的影响并不完全相同，这与两种单糖溶液的理化性质紧密相关。最适葡萄糖溶液比最适果糖溶液对延长大黄鱼精子激烈运动时间和精子寿命的效果更好，因此，葡萄糖较果糖更适宜作为海捕野生大黄鱼精子的激活液。而大黄鱼精子对这两种单糖吸收和利用的具体机制有待进一步研究。

致谢

宁德市富发水产有限公司提供试验鱼，在此表示衷心感谢！

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