RAD测序技术及其在水生生物研究中的应用

胡景杰，任红艳

( 国家自然科学基金委员会生命科学部，北京 100085 )

RAD测序技术是利用限制性内切酶消化降低基因组的复杂度，对特定的酶切片段进行高通量测序，实现基因分型的技术。RAD测序技术操作简便，能够不依赖参考基因组序列进行大规模SNP位点的开发，成为非模式生物尤其是水生生物最为有效、经济的SNP 开发方法，RAD测序技术已经应用于群体进化、遗传图谱构建、QTL定位、性状关联和系统发生分析等研究领域，提供了解析重要的复杂性状分子机制的有效途径。与此同时，在RAD测序基础上发展起来了多种新型的RAD测序技术为研究者提供了更多的选择。笔者综述了RAD测序技术的原理、几种RAD测序技术的比较及RAD测序技术在水生生物研究中的应用。

1 RAD-seq技术的定义

RAD标记是紧邻限制性内切酶酶切位点的一段短的DNA序列标签[1]，广泛分布于整个基因组。随着二代测序技术的快速发展和成本的降低，RAD-seq技术成为更具活力和应用价值的简化基因组测序方法[2-3]，RAD-seq技术在动植物的群体进化研究、遗传图谱构建和QTL定位以及全基因组关联分析上均得到了广泛的应用。RAD测序的流程主要为：(1)利用限制性内切酶对基因组进行酶切；(2)连接酶切片段与P1接头，P1接头序列包含有Illumina的通用引物结合位点和用于区分不同个体的barcode序列；(3)然后将带有接头的片段随机打断；(4)打断后连接上另一端接头P2；(5)对连接产物进行片段选择；(6)片段选择后的连接产物进行PCR扩增，富集得到两端含有正确接头的产物，最后进行高通量测序。RAD标签构成了一个简化的基因组，便于获得酶切位点附近的序列信息，从而发现SNP；选择的不同限制性内切酶，可以筛选出所需的足够数量的SNP标记。RAD-seq优点不仅体现在低成本的测序，更主要的是可对基因组所有酶切位点进行测序和分型，并且双末端测序平台的应用能够获得SNP位点的侧翼序列，为后续的研究带来极大的便利。对于无参考基因组的物种，也可进行大规模的SNP位点筛查，具有较高的准确性，可在较短的时间内完成变异检测及其他的生物学分析。RAD-seq技术广泛应用在模式生物和非模式生物的遗传分析，如三棘刺鱼(Gasterosteusaculeatus)的群体分化和选择的研究[4]，蚊子的系统进化研究[5]，虹鳟(Oncorhynchusmykiss)SNP标记开发[6]，大麦(Hordeumvulgare)高精度图谱构建的研究[7]等。

随着研究的深入，基于RAD-seq的改进技术也不断涌现，包括2b-RAD[8]、ddRAD[9]、ezRAD[10]和Rapture[11]等，这些方法在文库构建的难易程度、酶切标签的基因组覆盖度等方面存在一定差异。RAD-seq也为甲基化的检测提供了思路，例如，EpiRAD[12]和MethylRAD[13]技术，为缺乏基因组信息的非模式生物的甲基化研究提供了新的高效的方法。

1.1 2b-RAD技术

2b-RAD技术是对等长RAD标签进行测序分型的RAD技术[8]。IIB型限制性内切酶的能够识别双链DNA的6个特异碱基对，在识别位点的上下游将DNA酶切，产生出3′端带有3个随机碱基突出的33 bp标签。通过黏性末端的匹配使标签和接头连接，再经PCR扩增富集目的片段后进行高通量测序。该方法的准确性和实用性在模式生物拟南芥(Arabidopsisthaliana)中得到验证。由于等长标签扩增效率的一致性，使2b-RAD技术的分型准确率较高；无需片段选择，文库构建简便快捷，更为突出的特点是，2b-RAD技术可通过接头添加选择性碱基来调节获得基因组标签的密度，可以根据研究目的和需求开发SNP标记，易于控制成本。水生生物研究中往往进行样本数目较多的遗传分析，应用2b-RAD技术大规模开发SNP标记是一种低成本的快速有效的手段。Jiao等[14]利用2b-RAD技术对栉孔扇贝(Chlamysfarreri)全同胞F1作图家系进行了大规模SNP位点的开发，构建了高密度遗传连锁图谱。目前该技术已经广泛应用于马氏珠母贝(Pinctadamartensii)[15]、仿刺参(Apostichopusjaponicus)[16]、中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)[17]等水产生物的SNP标记的开发、遗传图谱构建和全基因组选育等[18]。

1.2 ddRAD技术

Peterson等[9]在2012年发明了ddRAD-seq(双酶切RAD测序)技术，以白足鼠(Peromyscus)为例，描述了其流程，并证实其方便实用。ddRAD-seq技术主要包括：(1)同时使用一种高频酶和一种低频酶酶切基因组DNA；(2)接头与酶切片段连接，其中P1接头和P2 接头分别设计有不同的突出序列，能够分别与两种酶的黏性末端互补进行连接；(3)连接产物混合后进行片段选择；(4)PCR扩增富集文库，引入索引序列增加平行测序样本通量。ddRAD技术与RAD-seq技术主要有两方面的改进：无需随机打断和末端修复，采用两种限制性内切酶同时处理基因组DNA，酶切标签数目提升，且起始DNA用量降低；其次，采用更为精准的片段大小选择方法，片段大小均匀性提高，进而个体间分型重复性和分型准确性均有提高。此外，ddRAD整个流程耗时8 h以内，比RAD-seq技术更为简易和节省成本。ddRAD-seq技术可应用于各种生物学问题的解析，Kai等[19]利用ddRAD技术筛选日本鳗鲡(Anguillajaponica)SNP标记，将2672 个SNP标记整合到遗传连锁图谱。目前该技术已经应用于贝类SNP标记开发和基因分型[20]、小丑鱼(Amphiprionbicinctus)景观遗传学研究[21]等。

1.3 ezRAD技术

Toonen等[10]在2013年发表了ezRAD(限制性酶切RAD)技术，其主要包括：(1)使用内切酶(一种或几种)消化基因组DNA至300～500 bp的片段范围；(2)使用Illumina TruSeq试剂盒建库并测序。由于使用商品化的试剂盒建库，流程简单快速，操作更为容易，但成本相对较高。其他RAD-seq技术通常需要通过选择特殊的内切酶或者通过选择不同的接头调整RAD标签的密度，但ezRAD对消化基因组的内切酶没有特殊要求，只要能将DNA酶切到一定片段长度范围即可。Toonen等[10]以珊瑚、软体动物、海星和海豚等多种非模式生物作为研究对象，对ezRAD技术的实用性和灵活性进行了评价，结果表明，该技术对各门类物种都具有广泛的适用性。

1.4 Rapture技术

Ali等[11]在2016年发表了Rapture(RAD捕捉)技术，其主要针对已知位点的标记开发，主要包括：RAD标签的分离、文库的测序及分析。该技术结合了RAD和捕获测序的优势，能够以较低的成本快速高效的对大量个体的测序位点进行分析。使用的物理方法富集RAD标签能够消除PCR引入的扩增偏离效应，覆盖更多的唯一比对位点，提高测序效率。Ali等[11]在虹鳟中证实了Rapture技术的可靠性，并分析了虹鳟的种群结构。该技术可广泛应用于农业、环境和生物医学等方面，提高遗传分析的效率。

1.5 EpiRAD技术

在ddRAD技术基础上，Schield等[12]发明了EpiRAD技术，该技术的将ddRAD技术中的一种酶替换为甲基化敏感性的内切酶HpaⅡ，通过对非甲基化位点的测序来检测基因组甲基化状态的变化。研究人员利用该技术检测了在有无捕食者的不同试验条件下，来源于同一克隆种群的水蚤(Daphniaambigua)世代间的基因组甲基化状态。结果显示，由于捕食者的存在，水蚤产生了表观遗传的变化，导致其生活史特征的改变。通过表观遗传分析探究了水蚤对鱼类捕食的适应方式及表型变化的主要机制。另外，研究人员还指出EpiRAD方法不仅可以用于无性繁殖群体的变异检测，对有性繁殖群体或者试验群体的检测同样适用。

1.6 MethylRAD技术

MethylRAD技术[13]是在2b-RAD基础上发展起来的一种适用于非模式生物的高效、低成本的全基因组DNA甲基化检测技术，与2b-RAD技术具有相似的建库流程，简便易操作。其原理是利用甲基修饰依赖型内切酶对基因组进行酶切产生包含有甲基化位点的标签，只对获取的甲基化标签进行测序，从而检测基因组范围内的甲基化位点。MethylRAD技术为非模式生物的甲基化研究提供了全新的技术方法和思路，可以通过表观调控水平上的比较分析筛选与性状调控相关的候选基因。Wang等[13]利用MethylRAD技术对“海大金贝”和普通虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)进行了全甲基化组比较分析，筛查得到调控“海大金贝”闭壳肌类胡萝卜素积累的重要候选基因LPCAT1。

2 几种RAD技术的比较

任何一种RAD-seq技术都有其优点和不足，对5种RAD技术的比较见表1。RAD-seq、ddRAD以及ezRAD技术构建的文库均具有较长的插入片段，使无参照基因组的RAD数据更易于de novo拼接，从而能够获得更多的基因组信息，方便位点的功能注释和SNP侧翼序列的引物设计。RAD-seq需要超声打断，超声打断具有片段长度选择的偏好性，会影响测序位点的基因组代表性及位点间测序深度的均匀度[22]。RAD-seq技术文库的构建流程过于繁琐，周期长，需要配备超声波DNA破碎仪等。Rapture技术使用物理方法富集RAD标签能够消除PCR引入的扩增偏离，覆盖更多的独立比对位点。2b-RAD、ddRAD和ezRAD技术建库流程相对要简单得多，ez-RAD技术可以利用Illumina TruSeq Kit试剂盒，易于操作，并且结合Illumina的无需PCR的样品制备方法，能够消除PCR扩增过程中的偏向性，但成本较高。2b-RAD和dd-RAD建库流程简便，可以通过多种方式(ddRAD通过选择不同的内切酶和片段大小，2b-RAD通过接头添加选择性碱基)灵活控制获得SNP数目，能够以很低的成本获得每个个体几百个数目的SNP位点，特别适用于只需少量位点的大样本的群体结构分析。2b-RAD可以对等长RAD标签进行测序，无需片段选择，所有酶切位点标签均能扩增测序，等长标签扩增时具有较好的一致性，因此标签在文库之间重现性强。值得一提的是，ddRAD技术采用了更精确的片段选择手段——全自动核酸电泳和片段回收系统，一定程度上可以降低片段选择过程对相同位点在文库间代表性的影响，另外通过试验初期的监测，可以评估样品酶切片段的均匀度，排除转座子等高频出现的片段。ddRAD可有效的应用于基因组较大并且未测序的物种。此外，RAD和ezRAD技术对起始基因组DNA质量的要求相对更高，2b-RAD技术建库不涉及打断和长片段选择的过程，DNA的降解对建库和结果的影响小，建库的起始量可低至1 ng[23-25]。

表1 5种RAD方法比较

3 RAD-seq数据生物信息分析

RAD-seq技术在图谱构建、全基因组育种及遗传进化等多个领域得到广泛应用，由于海量的数据分析，与RAD-seq技术相关的生物信息分析和高通量数据处理迅速发展。目前，常用的RAD-seq的生物信息学软件主要有Stacks[26]、RADtyping[27]、RADtools[28]和pyRAD[29]等。

Stacks是由俄勒冈大学 Julian Catchen 开发的适用于 RAD-seq序数据分析的软件[26]。该软件将最大似然法应用到无参考基因组的de novo SNP分型中，能消除测序错误对分型准确性的影响，可以处理各种类型的RAD-seq数据文件，适用于遗传图谱、群体基因组学及系统发生分析等研究。Stacks核心处理步骤主要包括5个模块：(1)利用process_radtags程序按照barcode区分样本序列并剔除掉测序质量不高的序列；(2)物种无参照基因组信息时，利用ustcaks聚类组成基因座位，有参考基因组信息时选择Pstacks程序；(3)利用cstcaks将双亲的基因座位进行整合；(4)通过stacks程序将亲本和子代的基因座位进行查找对应；(5)根据不同的研究方向，选择population或者genotypes进行群体或者图谱分析。

RADtyping是一套集成共显性和显性标记分型的流程化软件包，尤其适用于无参照基因组的非模式生物2b-RAD数据分析。对显性标记的分型有效提高了标记的利用率，能够降低测序成本。该软件提出了一种基于混合泊松/正态分布模型的de novo SNP分型新算法(iML)，能够有效消除重复序列对分型的干扰，通过模拟数据和实际测序数据的分析结果显示，iML的分型准确率明显提高，假阳性率可降低20%[27]。RADtyping整合了共显性和显性标记de novo分型算法实现所需的所有perl脚本，不仅可以处理单端测序的RAD数据，还适用于其他类型的双端测序的RAD数据。软件实现无参考基因组SNP de novo分型的核心步骤有3步：(1)利用亲本标签序列混合聚类构建代表性参考序列；(2)根据改进的极大似然法(iML)去除由于测序错误造成的低覆盖度的序列和重复序列造成的高覆盖度的序列，构建高质量的参考序列，并将获得的参考序列分为双亲共享和亲本特异的两种类型；(3)个体数据与两种类型的参考序列进行比对，根据软件算法进行共显性和显性标记的分型。

4 RAD技术在水生生物研究中的应用

4.1 水生生物遗传图谱的构建

水生生物的主要经济性状大都属于数量性状，其遗传机制比较复杂，受到多基因控制，要精确定位进行辅助育种需要高密度的连锁图谱。伴随着二代测序技术的快速发展和RAD-seq等简化基因组测序技术的出现，一次试验可筛查到数以千计的SNP标记，为高密度图谱构建提供了充裕的标记数目。RAD-seq技术不依赖于物种的基因组信息，在水生生物大规模分子标记开发和高密度遗传连锁图谱构建等研究领域得到了广泛应用。已发表的利用RAD-seq技术构建遗传图谱的水生生物包括斑马鱼、海带、海参、扇贝、虹鳟、尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)、日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicus)、比目鱼等等[14, 16, 30-35]。Li等[36]利用RAD-seq技术筛选了1373个分离的SNP标记构建了马氏珠母贝的遗传连锁图谱，对 7个生长性状进行了连锁分析。Ao等[37]利用RAD-seq技术构建的大黄鱼(Larimichthyscrocea)的图谱包含了10150个标记，标记间的平均间距0.54 cM。由4994个SNP标记构建的海带图谱，为评价种质资源和重要经济性状的遗传基础解析提供了有力的工具[34]。综上所述，利用RAD技术构建的水生生物图谱的标记数目都是数以千计，大大地突破了以往利用传统方法筛查标记所构建的图谱密度，对推动水生生物的遗传学研究具有重要的意义。

4.2 水生生物重要性状的分析

4.3 水生生物的种群遗传学研究

在种群遗传研究中通常利用少数个体进行标记开发，选取多态性高的位点进行种群遗传学分析，这些标记往往只反映该物种的一小部分多态性而难以准确推断不同种群的遗传距离和亲缘关系。RAD-seq技术可使SNP开发和分型同时完成，避免了上述缺点，为缺乏参考基因组或有着复杂进化史的生物种群多样性研究提供了有效手段。Hohenlohe等[4]通过RAD-seq技术研究了三棘刺鱼不同群体的种群分化，选取来自2个阿拉斯加南部的海洋群体和 3 个淡水群体的100 个个体，鉴定了基因组范围内45 789个SNP。评估了三棘刺鱼群体的遗传多样性, 发现2个海洋群体尽管相隔较远，但由于存在剧烈的基因流而无显著遗传分化。淡水群体和海水群体之间则表现出相对较大的遗传分化，在6个连锁群的9个区域有分化，这些区域覆盖12.2 Mb，包括590个基因，其中31个与骨骼发育和渗透压调节性状相关，这些基因对淡水的适应起重要作用，初步揭示了淡水三棘刺鱼适应性的平行进化机制。Larson等[44]对来自于阿拉斯加西部的5个大鳞大麻哈鱼(O.tshawytscha)的群体结构及趋异适应性问题进行了研究。利用RAD技术开发了10 944个SNP位点，对个体溯源的效率显著提高，同时还鉴定到733个位点和3个受选择的基因组区域。

海洋中存在数目巨大的浮游动物，由于没有天然的物理隔离屏障，有高频的基因交换，地理群体分化的研究一直是一个难题。RAD技术能够获得几百上千的SNP位点，能发现群体中存在的微小的遗传变异，高密度的SNP标记使群体分化系数和群体结构等参数的计算更为准确，为海洋生态群落结构的研究提供一种新的技术手段和方法。Blancobercial等[45]利用2b-RAD技术分析了北大西洋的海洋桡足类(Centropagestypicus)的群体结构，其结果与已知的形态学特征分析的结果一致。同时还研究了西北太平洋大陆架生态海域的群体遗传结构，比较了几种不同迁移方向的群体，结果表明应用2b-RAD技术进行海洋浮游动物群体结构的研究分析要显著优于其他技术方法。

4.4 水生生物的全基因组选择育种

全基因组选择是利用基因组范围内的遗传标记对生产性状进行育种值估算，从而达到标记辅助选择育种的目的。全基因组选择的前提是要有高密度的遗传标记。高通量低成本的简化基因组的SNP分型技术为水生生物的遗传育种研究提供了契机。Dou等[18]以虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)为材料，分析了2b-RAD技术在全基因选择育种中的应用潜力。模拟分析表明尽管该技术只获得基因组部分标记信息，但能够准确的估计出个体的育种值。值得一提的是2b-RAD技术具有标签密度易于调节的优势，为研究人员在分型成本和育种准确率之间提供了更多选择。同时对5个家系的349个虾夷扇贝进行2b-RAD标记分型(2364个高质量SNPs标记)，通过5倍交叉验证表明育种值的估计准确率约为0.4。这些分析表明2b-RAD技术可以为水生生物分子育种研究提供理想的标记分型平台。

4.5 水生生物的种间系统发生学研究

随着基因组时代的到来，研究人员可以通过基因组序列探讨物种间的进化关系。但是对于经济价值不高、基因组过大的物种来说，全基因组测序的方法并不合适。研究表明，RAD技术能够提供更多的基因组变异信息，是研究系统发生的有力工具[46]。山鳉(Orestias)是安第斯高原特有鱼类，形态特征聚类分析表明的的喀喀湖的山鳉鱼分为4个组，RAD-seq数据的分子系统学研究表明其中3个为共同起源[47]。Takahashi等[48]利用RAD数据，重建了东非洲丽鱼科的系统树，RAD数据构建的系统树与以前的研究结果有所不同，但RAD数据构建的系统树的自展值更高，结果更加可靠。RAD-seq技术可以不依赖基因组信息，就实现全基因组水平上的系统发生分析，侯睿[49]利用2b-RAD技术分析了扇贝科10个物种的系统发生关系，基于种间共享的2b-RAD标签构建的系统树与已知的根据形态分类的结果很相近。

4.6 水生生物的比较基因组学分析研究

比较基因组是通过不同物种基因组水平的比较，揭示基因组进化特征和机制，包括基因组保守性、重排和复制等。遗传连锁图谱是水生生物等非模式生物进行比较基因组研究的有力工具，利用RAD技术构建高密度图谱，能够提供更为全面的基因组结构信息。Braasch等[50]利用RAD-seq技术构建了斑雀鳝(Lepisosteusoculatus)的遗传图谱，利用图谱上将近1000个编码区的RAD标记对硬骨鱼、斑雀鳝和人的染色体进行了比较基因组学分析，证实了斑雀鳝与硬骨鱼的分化要先于硬骨鱼的基因组加倍，并且与硬骨鱼相比，斑雀鳝与人类基因组结构更为相似。Kakioka等[51]将鲤科属(Gnathopogon)2个近缘种杂交获得F2群体，利用RAD-seq技术，构建了包含有1622个标记的连锁图谱，平均图距为0.97 cM。根据获得的RAD标签序列，与斑马鱼、三棘刺鱼、青鳉鱼和河鲀进行了比较基因组学分析。结果表明该鱼有13个连锁群和斑马鱼染色体是共线性的，而其他的连锁群和斑马鱼染色体之间存在着重排。Lien等[52]以来源于142个家系的3297条大西洋鲑(Salmosalar)为材料，利用RAD技术构建了包含5650个SNPs的遗传图谱，并与三棘刺鱼进行了比较基因组分析，通过同源区域和变异区域，推测大西洋鲑具有特殊的性别特异性重组。

5 小 结

随着测序成本降低和测序能力的提高，不久的将来对每个研究对象个体进行全基因组测序将成为可能，但对于大多研究而言，全基因组测序往往得到过多的数据，造成信息量过剩，使分析复杂化，产生浪费。RAD测序技术由于具有的简便性、有效性、低成本等优势，水生生物无论基因组大小，是否具有参考基因组序列，均可应用RAD测序技术大规模开发SNP标记，实现精确的基因分型，开展遗传解析。因此，RAD测序技术在水生生物高密度遗传图谱的构建、QTL精细定位以及群体遗传和进化等领域具有广泛的应用前景。通过RAD测序技术获得的丰富的遗传标记信息能够有效地对水生生物群体的遗传多样性和系统发育进行分析，揭示群体的遗传结构，为水生生物育种和遗传改良提供基础性资料，对于优良性状的培育、种质资源研究等具有重要的意义。

[1] Miller M R, Dunham J P, Amores A, et al. Rapid and cost-effective polymorphism identification and genotyping using restriction site associated DNA (RAD) markers[J]. Genome Research, 2007, 17(2):240-248.

[2] Baird N A, Etter P D, Atwood T S, et al. Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers[J]. PLOS ONE, 2008, 3(10)：e3376.

[3] Etter P D, Bassham S, Hohenlohe P A, et al. SNP discovery and genotyping for evolutionary genetics using RAD sequencing[J]. Molecular Methods for Evolutionary Genetics, 2011:157-178.

[4] Hohenlohe P A, Bassham S, Etter P D, et al. Population genomics of parallel adaptation in threespine stickleback using sequenced RAD tags[J]. PLOS Genetics, 2010, 6(2):e1000862.

[5] Emerson K J, Merz C, Catchen J M, et al. Resolving postglacial phylogeography using high-throughput sequencing[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, 107(37):16196-16200.

[6] Hohenlohe P A, Amish S J, Catchen J M, et al. Next-generation RAD sequencing identifies thousands of SNPs for assessing hybridization between rainbow and westslope cutthroat trout[J]. Molecular Ecology Resources, 2011(11):117-122.

[7] Chutimanitsakun Y, Nipper R, Cuestamarcos A, et al. Construction and application for QTL analysis of a restriction site associated DNA (RAD) linkage map in barley[J]. BMC Genomics, 2011, 12(1):4.

[8] Wang S, Meyer E, Mckay J K, et al. 2b-RAD: a simple and flexible method for genome-wide genotyping[J]. Nature Methods, 2012, 9(8):808-810.

[9] Peterson B K, Kay E H, Fisher H S, et al. Double digest RADseq: an inexpensive method forDeNovoSNP discovery and genotyping in model and non-model species[J]. PLOS ONE, 2012, 7(5): e37135.

[10] Toonen R J, Puritz J B, Forsman Z H, et al. ezRAD: a simplified method for genomic genotyping in non-model organisms[J]. Peer J, 2013(1):e203.

[11] Ali O A, O′Rourke S M, Amish S J, et al. RAD capture (Rapture): flexible and efficient sequence-based genotyping[J]. Genetics, 2016, 202(2):389-400.

[12] Schield D R, Walsh M R, Card D C, et al. EpiRADseq: scalable analysis of genome wide patterns of methylation using next-generation sequencing[J]. Methods in Ecology and Evolution, 2016, 7(1):60-69.

[13] Wang S, Lv J, Zhang L, et al. MethylRAD: a simple and scalable method for genome-wide DNA methylation profiling using methylation-dependent restriction enzymes[J]. Open Biology, 2015, 5(11):150130.

[14] Jiao W, Fu X, Dou J, et al. High-resolution linkage and quantitative trait locus mapping aided by genome survey sequencing: building up an integrative genomic framework for a bivalve mollusc[J]. DNA Research, 2014, 21(1):85-101.

[15] Shi Y, Kui H, Guo X, et al. Genetic linkage map of the pearl oyster,Pinctadamartensii(Dunker) [J]. Aquaculture Research, 2009, 41(1):35-44.

[16] Tian M, Li Y, Jing J, et al. Construction of a high-density genetic map and quantitative trait locus mapping in the sea cucumberApostichopusjaponicus[J]. Scientific Reports, 2015(5):14852.

[17] Cui Z, Hui M, Liu Y, et al. High-density linkage mapping aided by transcriptomics documents ZW sex determination system in the Chinese mitten crabEriocheirsinensis[J]. Heredity, 2015, 115(3):206-215.

[18] Dou J, Li X, Fu Q, et al. Evaluation of the 2b-RAD method for genomic selection in scallop breeding[J]. Scientific Reports, 2016(6):19244.

[19] Kai W, Nomura K, Fujiwara A, et al. A ddRAD-based genetic map and its integration with the genome assembly of Japanese eel (Anguillajaponica) provides insights into genome evolution after the teleost-specific genome duplication[J].BMC Genomics, 2014,15(1):233.

[20] Kess T, Gross J, Harper F, et al. Low-cost ddRAD method of SNP discovery and genotyping applied to the periwinkleLittorinasaxatilis[J]. Journal of Molluscan Studies,2016,82(1):104-109.

[21] Saenz-Agudelo P, Dibattista J D, Piatek M J, et al. Seascape genetics along environmental gradients in the Arabian Peninsula: insights from ddRAD sequencing of anemonefishes[J]. Molecular Ecology, 2015, 24(24):6241-6255.

[22] Davey J W, Cezard T, Fuentesutrilla P, et al. Special features of RAD sequencing data: implications for genotyping[J]. Molecular Ecology, 2013, 22(11):3151-3164.

[23] Good J M, Miller M, Luikart G, et al. Harnessing the power of RADseq for ecological and evolutionary genomics[J]. Nature Reviews Genetics, 2016, 17(2):81-92.

[24] Hohenlohe P A, Miller M R, Hand B K, et al. Trade‐offs and utility of alternative RADseq methods: reply to Puritz et al[J]. Molecular Ecology, 2014, 23(24):5943-5946.

[25] Puritz J B, Matz M V, Toonen R J, et al. Demystifying the RAD fad[J]. Molecular Ecology, 2014, 23(24):5937-5942.

[26] Catchen J M, Amores A, Hohenlohe P A, et al.Stacks: building and genotyping lociDeNovofrom short-read sequences[J]. G3: Genes, Genomes, Genetics, 2011, 1(3):171-182.

[27] Fu X, Dou J, Mao J, et al. RADtyping: an integrated package for accuratedenovocodominant and dominant RAD genotyping in mapping populations[J]. PLOS ONE, 2013, 8(11): e79960.

[28] Baxter S W, Davey J W, Shelton A M, et al. Linkage mapping and comparative genomics using next-generation RAD sequencing of a non-model organism[J].PLOS ONE, 2011, 6(4): e19315.

[29] Eaton D A R. PyRAD: assembly ofdenovoRADseq loci for phylogenetic analyses[J]. Bioinformatics, 2014(30):1844-1849.

[30] Niu Y, Rastas P, Liu Y, et al. Genome-wide SNP identification for the construction of a high-resolution genetic map of Japanese flounder (Paralichthysolivaceus): applications to QTL mapping ofVibrioanguillarumdisease resistance and comparative genomic analysis[J]. DNA Research, 2015, 22(2):161-170.

[31] Lu X, Luan S, Hu L Y, et al. High-resolution genetic linkage mapping, high-temperature tolerance and growth-related quantitative trait locus (QTL) identification inMarsupenaeusjaponicus[J]. Molecular Genetics and Genomics, 2016, 291(3):1391-1405.

[32] Palaiokostas C, Bekaert M, Khan M G Q, et al. Mapping and validation of the major sex-determining region in Nile tilapia (OreochromisniloticusL.) using RAD sequencing[J]. PLOS ONE, 2013, 8(7): e68389.

[33] Hecht B C, Thrower F P, Hale M C, et al. Genetic architecture of migration-related traits in rainbow and steelhead trout,Oncorhynchusmykiss[J]. G3: Genes, Genomes, Genetics, 2012(2):1113-1127.

[34] Zhang N, Zhang L, Tao Y, et al. Construction of a high density SNP linkage map of kelp (Saccharinajaponica) by sequencingTaqI site associated DNA and mapping of a sex determining locus[J]. BMC Genomics, 2015, 16(1):189.

[35] Wilson C, High S, Mccluskey B M, et al. Wild sex in zebrafish: loss of the natural sex determinant in domesticated strains[J]. Genetics, 2014, 205(4):1291.

[36] Li Y, He M. Genetic mapping and QTL analysis of growth-related traits inPinctadafucatausing restriction-site associated DNA sequencing[J]. PLOS ONE, 2014, 9(11): e111707.

[37] Ao J, Li J, You X, et al. Construction of the high-density genetic linkage map and chromosome map of large yellow croaker (Larimichthyscrocea) [J]. International Journal of Molecular Sciences, 2015, 16(11):26237-26248.

[38] Wan S, Liu H, Zhao B, et al. Construction of a high-density linkage map and fine mapping of QTLs for growth and gonad related traits in blunt snout bream[J].Scientific Report, 2017(7): 46509.

[39] Houston R D, Davey J W, Lowe N R, et al. Characterization of QTL-linked and genome-wide restriction site-associated DNA (RAD) markers in farmed Atlantic salmon[J]. BMC Genomics, 2012, 13(1):244.

[40] Quin C T O, Drilea A C, Conte M A, et al. Mapping of pigmentation QTL on an anchored genome assembly of the cichlid fish,Metriaclimazebra[J]. BMC Genomics, 2013, 14(1):2.

[41] Oquin K E, Yoshizawa M, Doshi P, et al. Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefishAstyanaxmexicanus[J]. PLOS ONE, 2013, 8(2): e57281.

[42] Brown J K, Taggart J B, Bekaert M, et al. Mapping the sex determination locus in the hāpuku (Polyprionoxygeneios) using ddRAD sequencing[J]. BMC Genomics, 2016, 17(1):448.

[43] Palaiokostas C, Bekaert M, Davie A, et al. Mapping the sex determination locus in the Atlantic halibut (Hippoglossushippoglossus) using RAD sequencing[J]. BMC Genomics, 2013, 14(1):566.

[44] Larson W A, Seeb L W, Everett M V, et al. Genotyping by sequencing resolves shallow population structure to inform conservation of chinook salmon (Oncorhynchustshawytscha) [J]. Evolutionary Applications, 2014, 7(3):355-369.

[45] Blancobercial L, Bucklin A. New view of population genetics of zooplankton: RAD-seq analysis reveals population structure of the North Atlantic planktonic copepodCentropagestypicus[J]. Molecular Ecology, 2016, 25(7):1566-1580.

[46] Rubin B E R, Ree R H, Moreau C S. Inferring phylogenies from RAD sequence data[J]. PLOS ONE, 2012(7): e33394.

[47] Takahashi T, Moreno E. RAD-based phylogenetics forOrestiasfishes from Lake Titicaca[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2015,(93):307-317.

[48] Takahashi T, Sota T. A robust phylogeny among major lineages of the East African cichlids[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2016(100):234-242.

[49] 侯睿. 虾夷扇贝基因组结构特征与进化基因组学分析[D].青岛：中国海洋大学, 2012.

[50] Braasch I, Gehrke A R, Smith J J, et al. The spotted gar genome illuminates vertebrate evolution and facilitates human-teleost comparisons[J].Nature Genetics,2016,48(4): 427-437.

[51] Kakioka R, Kokita T, Kumada H, et al. A RAD-based linkage map and comparative genomics in the gudgeons (genusGnathopogon, Cyprinidae)[J]. BMC Genomics, 2013, 14(1):32.

[52] Lien S, Gidskehaug L, Moen T, et al. A dense SNP-based linkage map for Atlantic salmon (Salmosalar) reveals extended chromosome homeologies and striking differences in sex-specific recombination patterns[J]. BMC Genomics, 2011, 12(1):615.