微生态制剂在对虾病害防控中的应用开发进展

董小林，赵 敏，陈家林，刘家寿，钱雪桥

( 1.广东海大集团股份有限公司 畜牧水产研究中心, 农业部养殖用微生态资源与利用重点实验室，广东 广州 511400;2.中国科学院 水生生物研究所, 湖北 武汉 430072) )

1 对虾养殖病害现状及措施

1.1 对虾养殖的病害威胁

我国养殖产量较多、经济价值较高的对虾有凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)、斑节对虾(Penaeusmonodon)、日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicas)、中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)、长毛明对虾(F.penicillatus)、墨吉明对虾(F.merguienrsis)等[1]。但是目前养殖病害已经成为制约对虾产业发展的重要障碍，其中细菌性疾病是最主要的对虾疾病之一，尤其弧菌病是当前造成虾苗死亡的重要原因[2]。大量应用抗生素和消毒剂控制疾病会造成药物残留、细菌耐药性转移、生物抵抗力下降等严重后果[1,3]，欧洲许多国家已经明令禁止或限制抗生素在养殖业中的使用。相关法律法规和养殖环境的双重压力会使得抗生素或治疗型化学药物在水产养殖业上的应用越来越少，开发无药残、抗菌谱广、安全性高的免疫增强剂是当前对虾养殖业关注的重点。

1.2 对虾的免疫系统及免疫强化措施

对虾的免疫系统主要包括免疫器官(甲壳、鳃、血窦、淋巴器官)、免疫细胞(血细胞和淋巴细胞)和各种免疫因子(免疫相关的多肽和蛋白)[4]。对虾属低等无脊椎动物，主要依靠非特异性免疫系统来抵御感染，包括细胞免疫系统和体液免疫系统。其中血淋巴细胞在其免疫防御中起主导作用，细胞通过黏附作用、吞噬作用、趋化作用、包裹作用等过程直接参与免疫反应。体液免疫系统包括酚氧化酶系统、溶菌酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶。此外，凝集素、抗菌素、抗菌肽、活性氧等免疫因子也参与免疫反应。细胞免疫和体液免疫作用紧密相关，血细胞可合成并释放体液免疫因子，细胞免疫反应又受到体液免疫因子的介导和影响[5]。

一般使用一些免疫刺激剂来预防疾病。这类物质分为三类：营养物质的间接作用、特异性作用的疫苗、非特异性的免疫增强剂[1]。接种疫苗是目前渔业生产上预防传染性疾病最为有效的办法，但是对于特异性免疫系统不够发达或缺乏的虾类作用非常有限；而一些源自微生物细胞壁成分的免疫增强剂等有很强的剂量依赖性而难以把握。微生态制剂可以通过刺激非特异性免疫系统来提高动物的免疫力和对传染性疾病的抵抗力，这种免疫没有记忆且持续时间较短，比抗生素更安全，比疫苗作用更广泛。应用益生菌防治对虾疾病很有应用前途，相关研究已取得了显著成绩。

2 微生态制剂在对虾病害防控中的研究进展

2.1 对虾肠道菌群组成的研究是开发益生菌的基础

对虾肠道微生物多样性的研究是开发应用微生态制剂的基础。陆地养殖动物的常驻菌群则主要是革兰氏阳性的专性或兼性厌氧菌，如乳酸菌和链球菌等；而水产动物消化道的常驻菌群主要为革兰氏阴性的兼性厌氧菌，如甲壳类的常驻菌群是弧菌和假单孢菌。因为畜禽均为恒温动物，其消化道界面的温度、pH、氧化还原电位和渗透压等均相对较为稳定，而水产动物是变温动物, 在摄食和运动过程中，其消化道内外的微生物区系会不断受到水流的驱动[3]。这种生理上的差异就决定了水产动物消化道内的微生物区系稳定性不比人或畜禽，且随着水产动物的发育、季节的更替和环境的变化而发生显著变化。

早期主要采用传统的培养法研究对虾肠道微生物，近年来分子方法开始被大多数人采用。普遍认为，水生无脊椎动物肠道微生物主要有弧菌(Vibrio)、假单胞菌(Pseudomona)、气单胞菌(Aeromonas)、黄杆菌(Flavobacterium)和微球菌(Micrococcus)。早在20世纪80年代，Yasuda等[6]就分析了日本囊对虾不同发育阶段肠道菌群的组成，结果表明，溞状幼体阶段肠道菌群的优势菌群为弧菌属；成虾阶段为假单胞菌属；成长较差的成虾其肠道中有大量的气单胞菌和弧菌。Moss等[7]发现，对虾肠道优势菌为弧菌属、气单胞菌属和假单胞菌属。王祥红等[8]发现，弧菌属和发光杆菌属(Photobacterium)在野生中国明对虾肠道中为优势菌属。刘淮德等[9]指出中国明对虾肠道微生物主要由弧菌、光合细菌、不可培养细菌组成；弧菌为优势菌。Chaiyapechara等[10]从泰国8个养殖场取样70尾斑节对虾幼虾，采用PCR梯度变性凝胶电泳和16S rDNA技术测定了肠道菌群的组成。结果表明，肠道细菌的常见细菌均属于γ-变形菌门，每个虾场对虾的肠道优势菌群各不相同，分别属于弧菌属、发光杆菌属、气单胞菌属、丙酸杆菌属(Propionibacterium)；且不同养殖水体中的对虾其肠道菌群的结构差别很大。

2.2 益生菌的筛选及应用效果研究成果

引起对虾病害的主要细菌为革兰氏阴性菌，包括弧菌、假单胞菌、黄杆菌、气单胞菌和交替单胞菌(Alteromonas)等，其中以弧菌为主[1]。病原性弧菌主要有哈氏弧菌(V.harvey)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、鳗弧菌(V.anguillarum)等。研究表明，益生菌制剂可以改善对虾的肠道微生态构成，提高对虾生长率、成活率、免疫力及抗病力等。有益菌的抗病保护作用主要是通过以下两种途径：一是激活细胞和体液免疫系统，从而提高虾体的免疫力；二是通过在虾消化道中的竞争排斥作用减少肠道中的有害菌群，降低其致病机会。益生菌的竞争排斥和免疫刺激是对抗病原的有效机制[11]。还有研究表明，一些益生菌能阻止并修复由来自食物的抗原或药物作用引起的黏膜层损害[12]。此外，益生菌还可以产生一些消化酶类，增强机体的消化能力，提高抗应激能力和健康状况。

用陆生生物的细菌作为水生动物的益生菌往往效果并不理想，这是因为菌株的生理生化特性具有环境依耐性[13]。因此许多从虾塘或虾的肠道及肝胰腺中分离益生菌菌株的报道大量涌现。笔者重点介绍对虾益生菌的候选菌株、作用机制及其在对虾养殖应用上的挑战，为对虾益生菌产品的应用开发提供参考。

2.2.1 芽孢杆菌

革兰氏阳性菌，尤其是芽孢杆菌(Bacillus)可以产生大量的蛋白酶和淀粉酶等胞外酶，在对虾中应用可增加肠道脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶的活性，提高对虾饲料的消化率；但是很难对虾体自身消化酶和芽孢杆菌胞外酶进行区分和定量[14]。Ziaei-Nejad等[15]评价了芽孢杆菌属的益生菌对对虾消化酶活性、生长和存活的影响，表明芽孢杆菌产生的酶类能有效将碳水化合物、脂类和蛋白降解成小分子物质。虽然芽孢杆菌分泌大量胞外酶的优势特性是其被关注的重点，但是其对对虾病原性弧菌的拮抗作用也有较多的报道，Vaseeharana等[16]指出枯草芽孢杆菌(B.subtilis)BT23在实验室条件下能抑制病原性弧菌。Balcázar等[17]从凡纳滨对虾肠道分离到的枯草芽孢杆菌UTM126对对虾的致病菌副溶血弧菌PS-017有明显的拮抗作用。但是体外拮抗效应并不能反映体内对病原菌的抑制效果，因此通过活体试验评价芽孢杆菌对病原性弧菌的抑制功效具有重要意义。

Rengpipat等[11,18]研究表明，饲喂芽孢杆菌S11菌株时斑节对虾生长良好，抗菌能力增强，受到107个/mL 致病菌哈氏弧菌的人工感染以后，其存活率显著高于对照组。Gullian等[19]从凡纳滨对虾中肠腺分离出益生菌芽孢杆菌P64菌株，对哈氏弧菌S2的抑制率为34%，在对虾肝胰脏的定殖率为58%，表明该菌株具有益生菌和免疫刺激剂特性。Balcázar等[17]从凡纳滨对虾肠道分离到的枯草芽孢杆菌UTM126对对虾的致病菌溶藻弧菌、副溶血弧菌和哈氏弧菌均有明显的拮抗作用。饲喂含有105cfu/g益生菌的饲料28 d后，用105cfu/mL的哈氏弧菌浸泡攻毒，其死亡率仅为18.25%，显著低于对照组的51.7%。朱学芝等[20]在基础饲料中添加1010cfu/g的枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌(B.lincheniformis)饲喂初始体质量约4.5 g的凡纳滨对虾，40 d后用107cfu/mL溶藻弧菌水浴攻毒。结果表明，芽孢杆菌能显著提高凡纳滨对虾血细胞总量及血清酚氧化酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶的活性，增强其免疫机能；攻毒14 d内，对照组的累计病死率显著高于试验组。王玲等[21]的研究表明，在饲料中添加600 mg/kg的枯草芽孢杆菌制剂BS3755(2×109cfu/g)可以显著提高凡纳滨对虾的生长率，降低饲料系数，并可以提高其非特异性免疫力(酸性磷酸酶、酚氧化物酶)。Liu等[22]从健康的凡纳滨对虾肠道中分离到枯草芽孢杆菌S12菌株。将此株菌以5×109cfu/kg、5×1010cfu/kg、5×1011cfu/kg、5×1012cfu/kg的剂量添加到对虾饲料中，可显著提高对虾的生长和存活率；4周和8周时用哈氏弧菌攻毒的结果显示，益生菌组的死亡率低于空白对照组。Hao等[23]表明, 凡纳滨对虾摄食含添加蜡质芽孢杆菌(B.cereus)D4(107cfu/g)的饲料时，生长性能显著提高；非特异性免疫性能如超氧化物歧化酶、呼吸爆发、酸性磷酸酶活性等均比对照组增强；用哈氏弧菌攻毒后，处理组的死亡率显著低于对照组。Niu等[24]发现芽孢杆菌LT3能够在对虾肠道中定殖，激活酚氧化酶原系统，提高机体的免疫应答，进而提高了对虾对抗坎氏弧菌(V.campbellii)的能力。

许多情况下直接在养殖水体中添加有益微生物，利用其拮抗病原、降解多余有机质等，对养殖动物产生有益的影响。芽孢杆菌在对虾养殖水体中的应用非常广泛，有关在虾池中施用芽孢杆菌对水体和对虾肠道菌群、对虾免疫机能和抗应激能力的影响也有较多报道。李卓佳等[25]对凡纳滨对虾的研究结果表明，施用芽孢杆菌制剂的虾池对虾肠道可培养细菌数量为3.4×107cfu/g，优势菌群为弧菌属和发光杆菌属；未施用益生菌的虾池细菌数量为5.8×1012cfu/g，优势菌群为假单胞菌属和弧菌属。虾池施用芽孢杆菌制剂，可促进养殖对虾肠道微生物群落的代谢功能。Liu等[26]将一株自人类健康食品纳豆中分离到的枯草芽孢杆菌E20应用到凡纳滨对虾的育苗水体中，添加枯草芽孢杆菌E20 109cfu/L可以明显加快幼虾的发育，提高存活率；枯草芽孢杆菌E20还降低了水体的细菌总数和弧菌数；在进行温度、盐度、氨氮胁迫时，益生菌组的后期幼体的累计死亡率明显低于对照组，免疫相关酶基因表达显著高于对照组。Zokaeifar等[14,27]研究发现，将分离到的枯草芽孢杆菌L10和G1分别以105cfu/mL和108cfu/mL的剂量添加至凡纳滨对虾的养殖池水中，水体的氨氮、亚硝酸盐显著降低；对虾的特定生长率、饲料利用以及存活率均显著提高；8周以后用哈氏弧菌ATCC14126攻毒，对照组的累积死亡率高达80%，而益生菌组的累积死亡率分别为36.7%和50%，说明枯草芽孢杆菌从多个角度改善了对虾的生长性能、健康状况和抗病力。

芽孢杆菌在对虾养殖中经常被用于降低弧菌数量，对抗鱼虾的多种病原菌。考虑到芽孢杆菌属的优势特征，它们将是对虾养殖病害防控上良好的益生菌候选菌[28]。

2.2.2 乳酸菌

乳酸菌类可分泌特殊产物，还具有细胞表面的蛋白抗原和黏液黏附受体蛋白等生理生化特征，已经作为益生菌广泛应用于陆生动物和鱼类养殖[29]。乳酸菌能使无菌动物和常规小鼠肠道绒毛膜层细胞增殖，也能通过提高肠上皮细胞的成活率使肠道黏膜层的损伤修复[30]。

Chiu等[31]指出饲喂含植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)的饲料，提高了凡纳滨对虾的免疫能力和抗弧菌感染能力，但是处理组的血细胞数降低。但实际生产过程中，水产饲料的调质制粒环节需要高温高湿和高压的条件(温度90～105 ℃)，才能使得饲料中的淀粉适度熟化保证饲料的耐水性等要求；而乳酸菌对高温等的抗逆性较差，在该加工温度下基本已完全灭活，因此在一定程度上限制了其在水产饲料上的直接应用。Bussarin等[32]为了开发应用于凡纳滨对虾饲料中的耐热益生菌候选菌株，从经过高温处理后的健康对虾中分离到2株乳酸菌菌株：肠道原著菌植物乳杆菌ID1L和外来菌乳酸短乳杆菌(L.brevis)860，它们均对弧菌等病原菌有拮抗作用；进一步研究这两株乳酸菌的热适应性能，并做现场饲料加工评价，证实该乳酸菌类在虾料生产中采用高温喷雾的方式可行。王国霞等[33]在凡纳滨对虾饲料中添加2.0×109cfu/mL的液体嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)发酵72 h，投喂8周。试验表明，10%乳酸菌添加可一定程度上提高凡纳滨对虾的生长性能和消化酶活性，改善其非特异性免疫力。

乳酸菌能够产生抑制因子如细菌素以有效抑制革兰氏阳性菌，但是水产养殖中很多病原菌是革兰氏阴性菌，并且乳酸菌一般占水生动物肠道菌总数的约10%，其抗逆性也较差，因此乳酸菌在水产养殖上作为拮抗病原菌的益生菌的研究还有较大争议[34]。尽管如此，由于乳酸菌具有分泌多种益生物质、修复肠道损伤、提高机体非特异免疫机能、改善消化吸收等功效，因此在对虾的健康维护上具有突出效果，进而可以间接提高对虾的抗病原菌能力。因此，乳酸菌在对虾病害防控上的应用效果依然值得肯定，但是需要通过后喷涂、拌料、筛选耐高温菌株等方式解决乳酸菌抗逆性差的问题。

2.2.3 弧菌

多种弧菌是对虾的病原菌。尽管溶藻弧菌的一小部分菌株是病原菌，但它的大多数菌株有着独特的生物特性。Adams[35]的研究发现，热灭活的溶藻弧菌能激活部分斑节对虾的非特异性免疫反应。Gullian等[19]从凡纳滨对虾中肠腺分离出益生菌弧菌P62和P63菌株，对哈氏弧菌S2的抑制率分别为54%和19%，在对虾肝胰脏的定殖率分别为83%和60%，可能表现为益生菌特性而无免疫刺激特性。Alavandi等[36]从斑节对虾的肠道中分离到河流弧菌(V.fluvialis)PM17作为益生菌的候选菌，因为该菌株的筛选标准是其产胞外酶和铁载体的能力以及其生长特性，没有考虑其对对虾免疫力的提高，因此河流弧菌PM17的应用使斑节对虾的血细胞数量、酚氧化酶活性和血淋巴抗菌活力随着时间的延长却逐渐下降。Balcázar等[17]证实从凡纳滨对虾肠道分离到的溶藻弧菌UTM102对对虾的致病菌副溶血弧菌 PS-017有明显的拮抗作用。

考虑到弧菌在对虾养殖中的潜在病原特性，其益生菌菌株需要特别关注减低其转化为病原菌的风险。

2.2.4 假单胞菌

假单胞菌是土壤、淡水和海水环境中的常见菌种，能够产生大量的次生代谢产物抑制多种病原菌。假单胞菌和弧菌是对虾养殖环境中的常见菌种。Chythanya等[37]筛选出一株对哈氏弧菌、河流弧菌、副溶血弧菌、美人鱼弧菌(V.damsel)和创伤弧菌(V.vulnificu)均有抑制作用的假单胞菌I-2，其抑菌物质具有热稳定性，溶于氯仿，耐受蛋白酶的小分子化合物。Alavandi等[36]从斑节对虾的肠道中分离到假单胞菌PM11作为益生菌的候选菌。Vijayan等[38]从半咸水湖泊中分离到一株假单胞菌PS-102，该菌株能够抑制多种对虾和沼虾养殖环境中的病原性弧菌，其对温度、pH和盐度的广泛耐受也表明该菌株是对虾养殖的优良益生菌候选菌。Balcázar等[17]从凡纳滨对虾肠道分离到的假单胞菌SLV22对对虾的致病菌副溶血弧菌PS-017有明显的拮抗作用。

2.2.5 其他益生菌

针对对虾病原性弧菌的益生菌筛选有较多的研究，除了上述几种外，还报道了其他一些益生菌候选菌株。李会荣等[39]从健康斑节对虾幼体及其养殖环境中，分离出5 株对水产养殖动物病原菌哈氏弧菌和鳗弧菌等生长有抑制作用交替单孢菌。李继秋[40]从中国明对虾养殖水体中分离出一株烟草节杆菌(Arthrobaternicotianae)XE-7，其对副溶血弧菌、鳗弧菌和沙蚕弧菌(V.neresis)有明显拮抗作用。XE-7抑制水体弧菌的效果与氯霉素相当；添加到饲料中能提高凡纳滨对虾的生长率和对副溶血弧菌的抵抗力。张新明[41]从健康的对虾体内及养殖水体中筛选到对鳗弧菌H-2、副溶血弧菌1614、沙蚕弧菌1623、漂浮弧菌(V.natriegen)1594等病原菌有拮抗作用的6株海洋细菌，其中微球菌J-10对病原菌的拮抗作用最强。将J-10添加到饲料中投喂凡纳滨对虾，对虾的酚氧化酶活性、抗菌活力和溶菌活力、溶血素活性、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和血清蛋白含量等免疫指标均优于对照组。用副溶血弧菌进行人工攻毒，免疫保护率达到40%。Balcázar等[17]从凡纳滨对虾肠道分离到的玫瑰杆菌(Roseobactergallaeciensis) SLV03对对虾的致病菌副溶血弧菌PS-017有明显的拮抗作用。张玲[42]从耐受过白斑病毒的中国明对虾肠道中分离到一株海洋细菌嗜盐单胞菌(Halomonas)B12，并从免疫学、肠道微生物学和组织学的角度，探讨其对对虾的作用机理。结果表明，饲料中添加7.18×1010cfu/g的海洋细菌嗜盐单胞菌B12显著提高了中国明对虾肠道总菌数，降低了肠道弧菌数，提高中国明对虾幼体的成活率和对哈氏弧菌和副溶血弧菌的抗病力，改善了对虾养殖水体水质。杨世平等[43]将从对虾养殖水体中分离到的沼泽生红冬孢酵母(Rhodosporidiumpaludigenum)添加到凡纳滨对虾基础饲料中，显著减少了对虾肠道内弧菌数以及弧菌与总细菌的比例。Wen等[44]通过共培养及电镜观察表明，蛭弧菌(Bdellovibrio)DA5对溶藻弧菌有明显的溶菌能力，试验感染的凡纳滨对虾存活率较高。

2.3 益生菌的使用方法是提高其功效的关键

益生菌使用的剂量、时间、使用方法(饲入、浸泡、口服、投水)、生物条件等是影响益生素有效性的关键因素[3]。一般认为适宜的益生菌剂量为105cfu/mL以上，剂量过高或持续时间过长可能引起非特异性免疫系统的持续反应而形成免疫抑制[45]。需要强调的是，用益生菌防控病害应提前使用。一般来说，通过饲料摄入是益生菌使用方法中最为方便和实用的方式；浸泡法虽然效果较好，但是需要从虾池中转移虾体，由此带来的应激较大；口服法一般是做成保健剂，然后与饲料进行混合饲喂，劳动强度较大，因此养殖户难以坚持执行；投水法是直接将益生菌投放在养殖水体中，由于水体环境复杂多变，因此效果极不稳定。因此，开发功能性益生菌饲料，是益生菌发挥良好效果的重要措施。

3 现状与展望

目前对虾中益生菌开发的研究大部分集中在对病原菌有显著抑制作用或有效提高虾体非特异性免疫机能的益生菌候选菌的筛选上，大多菌株来自虾塘水体或底泥、对虾肠道或肝胰腺，不过也有少数学者从发酵的泡菜等其他途径筛选对抗弧菌的益生菌菌株。筛选到的菌株需要进行安全性评估、药敏试验、抗逆性试验、生长特性评价和优化等一系列的评估[46]。而提高候选菌株的抗逆性是饲用益生菌面临的最大难题。

而评价益生菌的应用效果，一般采用微生物学、微生物生态学、组织学、免疫学、生理学和营养学等方法，探讨益生菌的有益作用机制，包括生长和消化(消化酶、消化率、饲料转化率)、免疫指标(血细胞数、酚氧化酶活性、血浆蛋白浓度、超氧化物歧化酶、细胞吞噬率、抗菌活性、呼吸爆发活性等)、抗病力(注射或浸浴病原菌)、对肠道菌群和肠道组织的影响、对水质和水体菌群组成的影响等。研究益生菌抗病效果，一般采用典型病原菌攻毒法。对病原菌菌株的选择要有针对性，且最好探讨对多种病原的免疫力，因为实际生产中的病害爆发并不是某一种病原菌所致。益生菌的作用位点是肠道，对肠道的评价对于揭示益生菌的作用机理至关重要[47]，但是由于肠道环境的复杂，研究繁琐，使得益生菌对机体肠道的作用机理研究较少，仅对益生菌肠道细菌总数、异养菌数量、病原菌数量等的影响进行了简单的比较研究，有关体内的作用机制尚不清楚。

益生菌对对虾疾病和健康的调控效力已经比较确定[48]。但是受陆生动物益生菌产品以及行业制度的制约，目前市场上的水产用益生菌产品多是芽孢杆菌和乳酸菌，少数产品也有和酵母菌组合。当前应用于对虾养殖中的益生菌制剂菌种单一，针对性不强，作用效果不稳定。一般来说，复剂比单一菌株的效果要好，而商业益生菌产品的复配多为缺乏依据的组合。此外有关益生菌和中草药、免疫多糖及酶制剂的复配也值得关注。

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