海洋来源褐藻胶裂解酶分离纯化及酶学性质研究

韩 伟,许鑫琦,叶秀云,林 娟

(福州大学生物科学与工程学院,福建省海洋酶工程重点实验室,福建 福州 350116)

0 引言

褐藻胶(Alginate)是由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)两种单体组成的二元线型嵌段化合物,属于水溶性酸性海藻多糖. 根据其聚合方式不同,可分为同聚物G、 同聚物M和异聚物G/M三种[1]. 褐藻胶因粘度大且为生物大分子不易被机体有效吸收,限制了其应用. 随着海藻寡糖生理活性研究的不断深入,发现褐藻胶水解后生成的褐藻寡糖在抗凝血,降低血糖、 血脂,抗自由基,抗肿瘤等方面效果良好[2-6],低聚合度的褐藻寡糖还具有调节植物生长和防病害的作用. 褐藻胶裂解酶作为一种海藻工具酶[7],相较于物理、 化学方法制备褐藻寡糖,具有反应条件温和、 专一性强、 副产物少、 酶解产物得率高等优点, 同时, 褐藻胶裂解酶在防治肺囊性纤维化病及制备海藻原生质体等方面也有重要作用[8-9],因此褐藻胶裂解酶的开发应用引起了国内外学者的关注.

微生物是产褐藻胶裂解酶的主要类群,包括弧菌(Vibrio)、 产微球茎菌(Microbulbifer)、 假单胞菌(Pseudomonas)、 克雷伯氏菌(Klebsiella)、 白蚁菌(Isoptericola)、 黄杆菌(Flavobacterium)、 芽胞杆菌(Bacillus)等[10-18]. 但微生物来源不同其酶学性质(最适温度、 pH、 pI、 分子量、 底物特异性等)也会有所差异. 本研究以假交替单胞菌Pseudoalteromonassp. zb7-4发酵制备褐藻胶裂解酶,用于酶学性质研究及酶动力学参数测定,为褐藻胶裂解酶的开发应用奠定基础.

1 实验材料

1) 菌株. 假交替单胞菌zb7-4(Pseudoalteromonassp. zb7-4),从舟山群岛海水中分离获得.

2) 主要试剂. ① 褐藻酸钠购自西陇化工股份有限公司； DNS试剂参照文[19]配制. ② 2216E培养基： 蛋白胨5 g,酵母膏1 g,FeCl3·6H2O 0.018 g,人工海水溶解并定容至1 L,pH 7.0～7.2. ③ 发酵培养基： 褐藻酸钠2 g,酵母膏2 g,蛋白胨2 g,(NH4)2SO43 g,人工海水溶解并定容至1 L,pH 7.0. ④ 4份人工海水： MgCl2·6H2O 8.4 g,MgSO4·7H2O 16.8 g,KCl 3.6 g,CaCl2·2H2O 5.48 g,NaCl 106 g,蒸馏水溶解并定容至1 L. ⑤ 缓冲液： 分别配制pH 4.0～7.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液(0.1 mol·L-1Na2HPO4/ 0.1 mol·L-1柠檬酸),0.1 mol·L-1pH 7.0～9.0的Tris-HCl缓冲液,0.1 mol·L-1pH 9.0～11.0的甘氨酸-NaOH缓冲液.

3) 主要仪器设备. AKTA Pure系统和Hi TrapTMDEAE FF预装柱,Spectrophotometer(1510,美国 Thermo Fisher Scientific公司)； 高速冷冻离心机(Lynx 4000,美国 Thermo Fisher Scientific公司)； 恒温培养振荡器(ZWY-2101C型,上海智城分析仪器制造有限公司).

2 实验方法

2.1 褐藻胶裂解酶粗酶液制备

将假交替单胞菌zb7-4在2216E固体平板上划线活化,30 ℃培养24 h； 挑取单菌落于50 mL的2216E液体培养基中培养12 h (30 ℃,200 r ·min-1),以2%体积比转接至发酵液体培养基(50 mL/250 mL)中,20 ℃、 200 r ·min-1摇瓶培养24 h. 将菌液于4 ℃、 10 kr ·min-1离心15～20 min,收集上清液即为褐藻胶裂解酶AlgL粗酶液.

2.2 褐藻胶裂解酶分离纯化

利用10 ku中空纤维柱对粗酶液进行浓缩,浓缩液采用Hi TrapTMDEAE FF预装柱进行分离,上样和洗脱缓冲液均为20 mmol·L-1磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH6.5),用含有1 mol·L-1NaCl的上述缓冲液进行线性梯度洗脱(洗脱NaCl浓度55%,洗脱时间240 min),上样流速为4 mL·min-1,洗脱流速为1 mL·min-1,每4 min收集1管,280 nm检测收集蛋白[20]. SDS-PAGE检测纯度.

2.3 褐藻胶裂解酶比活力测定

采用Easy ⅡProtein Quantitative Kit测定蛋白浓度,DNS法测定酶活力[21],计算比活力. 酶活力单位定义： 每分钟催化底物产生1 μmol 还原糖所需的酶量作为一个酶活力单位(U),比活力(U·mg-1)=酶活力(U·mL-1)/蛋白浓度(mg·mL-1).

2.4 褐藻胶裂解酶蛋白测序及序列分析

纯化的褐藻胶裂解酶经SDS-PAGE 电泳后,将单一条带的胶割下送至厦门大学生命科学学院分析测试中心进行LC-MSMS测序; 采用SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/interactive)在线对褐藻胶裂解酶AlgL进行三维建模； 用NCBI数据库进行褐藻胶裂解酶AlgL的结构域分析； 利用软件Gromacs 5.0对AlgL的分子动力学曲线预测.

2.5 褐藻胶裂解酶最适反应pH及pH稳定性

在50 ℃条件下,测定该酶在不同pH(4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11)缓冲液体系中的酶活力,以测定的最高酶活力为100%,计算不同pH下的相对酶活力,确定最适反应pH.

将酶液与上述不同pH范围的缓冲液按照一定比例混合,37 ℃水浴中保温1 h,在最适反应条件(50 ℃,缓冲体系pH=7.0)下测定酶活力. 以测得的最高酶活力为100%,计算褐藻胶裂解酶在各pH下的残余酶活力.

2.6 褐藻胶裂解酶最适反应温度及其热稳定性

在pH=7.0的缓冲体系中,测定酶液在不同温度(4、 30、 40、 50、 60、 70、 80 ℃)下的酶活力,以测定的最高酶活力为100%,计算不同温度下的相对酶活力,确定最适反应温度.

将酶液分别于不同温度水浴中保温,并在相应的时间点取样,测定该酶在最适反应条件(50 ℃,缓冲体系pH=7.0)下的酶活力,将未处理的酶液作为对照,计算各温度条件下褐藻胶裂解酶的残余酶活力.

2.7 褐藻胶裂解酶催化动力学参数测定

选取褐藻酸钠、 聚古罗糖醛酸钠(Poly G)和聚甘露糖醛酸钠(Poly M)作为底物测定动力学参数. 改变底物浓度,测定最适反应条件下的酶活力,采用Lineweaver-Burk法以1/V对1/[S]作图,计算动力学参数Km、Vmax及Kcat[12,22].

2.8 褐藻胶裂解酶热失活动力学参数测定

参照酶热稳定性试验,改变保温温度(323、 325、 327、 329 K)测定酶活力,计算不同温度下酶的热失活速率常数k[23],根据Arrhenius公式,酶热失活反应的速度常数k与反应的活化能关系为：

(1)

以酶热失活反应速度的对数(lgk)对1/T作图,得到直线关系图,根据Eyring的绝对反应速度理论,可以求出酶在不同温度下热失活的焓变(△H≠)、 自由能(△G≠)和熵变(△S≠).

其计算公式为：

(2)

其中: Ea为酶解反应的活化能； R为气体常数(8.314J·mol-1·K-1)； T为绝对温度； k为在温度T下酶热失活反应的速度常数； KB为Boltzmann常数(1.381×10-23J·K-1)； h为Plank常数(6.626×10-34J·s).

2.9 不同金属离子对褐藻胶裂解酶活力的影响

在酶促反应体系中分别添加终浓度为1和5mmol·L-1的13种金属离子,以未添加金属离子的酶促反应组作为对照组,在最适反应条件下测定酶活力.

2.10 NaCl浓度对褐藻胶裂解酶活力的影响

图1 褐藻胶裂解酶AlgL的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analyses of alginate lyase AlgL

在酶促反应体系中分别添加不同终浓度的NaCl,以未添加NaCl的酶促反应组作为对照,在最适反应条件下测定酶活力.

为检测该酶的耐盐性,将酶液分别置于浓度为2和3mol·L-1NaCl反应体系中,37 ℃水浴保温120min,并在不同时间点取样测定其剩余酶活力.

3 结果与分析

3.1 褐藻胶裂解酶的分离纯化

采用中空纤维柱浓缩、 硫酸铵分级沉淀、 离子交换层析、 凝胶色谱层析以及亲和层析等方法分离纯化褐藻胶裂解酶AlgL,最终发现经10ku中空纤维柱浓缩和弱阴离子DEAE交换层析两步分离,已达到电泳纯(图1). 该酶的相对分子质量约为32ku. 采用DNS法测得该酶活力为15.07U·mL-1,在pH为7.0、 50 ℃条件下对0.4%褐藻酸钠底物的比活力为(208.26±5.87)U·mg-1.

3.2 褐藻胶裂解酶最适反应pH和pH稳定性

以0.4% 褐藻酸钠为底物,测得褐藻胶裂解酶的最适反应pH=7.0 (图2). 将该酶与不同pH缓冲液混合于37 ℃保温60min,测定其剩余酶活力,结果(见图2)显示,在pH6.0～10.0残留酶活力大于80%,表明该酶具有较宽广的pH稳定范围.

3.3 褐藻胶裂解酶最适反应温度和温度稳定性

以pH=7.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液配制0.4%的褐藻酸钠底物,测定不同温度下褐藻胶裂解酶AlgL活力,图3显示该酶的最适反应温度为50 ℃. 热稳定性试验表明,该酶在40 ℃以下相对稳定,残留酶活力大于80%(图3)； 温度升高,酶活力明显下降,温度高于60℃时,该酶几乎完全失活.

图2 AlgL在不同pH时的酶活Fig.2 AlgL activity at different pH

图3 AlgL在不同温度时的酶活Fig.3 AlgL activity at different temperature

3.4 褐藻胶裂解酶催化动力学参数测定

褐藻胶裂解酶AlgL对聚甘露糖醛酸钠(PM)、 聚古罗糖醛酸钠(PG)和褐藻酸钠三种底物的催化动力学参数见表1. 根据Km值的大小可以判断酶对底物的亲和力强弱,由结果可知该酶对3种底物的亲和力大小为：PG>PM>褐藻酸钠； Kcat是酶的催化常数,酶催化底物的能力大小顺序为PM>褐藻酸钠>PG,说明AlgL是PM偏好型的双功能酶,作用于聚甘露糖醛酸片段的效果大于聚古罗糖醛酸片段.

表1 AlgL对不同底物的米氏常数和特异性Tab.1 Kinetic constants of AlgL for hydrolysis of various substrates

3.5 褐藻胶裂解酶热失活动力学参数测定

红色部分为209至217位氨基酸片段图4 褐藻胶裂解酶AlgL三维结构图 Fig.4 Three-dimensional structures of alginate lyase AlgL

经LC-MSMS测序获得纯化酶AlgL蛋白序列,利用SWISS-MODEL在线进行同源建模,以细菌Pseudoalteromonassp. SM0524来源的蛋白(PDB编号为4q8k.1.A)为模板,对AlgL中第174～400个氨基酸进行结构模拟,得到一个高同源性的蛋白结构(相似性99%,见图4),序列一致性达100%. 利用Gromacs 5.0对AlgL的分子动力学曲线进行预测,结果见图5. RMSF值的高低表明该氨基酸构象的稳定性,Gln209-Gly217氨基酸的RMSF值最高,柔性较大,构象不稳定,并且其位于AlgL的催化活性中心Asp197-Glu385,该段构象不稳定的区段(见图4红色线型)很可能影响到蛋白质的热稳定性. 对此,测定了AlgL在不同绝对温度(323、 325、 327、 329 K)反应体系中,酶活随时间变化曲线(见图6),测得失活速率常数,从而计算出该酶在不同温度下的热失活动力学参数,包括活化能(Ea)、 焓(ΔH≠)、 自由能(ΔG≠)和熵(ΔS≠),纯化酶AlgL的Ea为328.527 kJ·mol-1,随着绝对温度升高,该酶的失活速率常数k逐渐增大,ΔH≠和ΔG≠逐渐降低而ΔS≠的数值保持相对稳定(见表2).

图5 AlgL酶蛋白分子动力学模拟结果Fig.5 Results of the kinetics calculate of AlgL

图6 AlgL的温度稳定性Fig.6 Temperature stability of AlgL表2 AlgL的热失活动力学参数Tab.2 Thermal inactivation kinetics parameters of AlgL

T/Kk/s-1Ea/kJ·mol-1ΔH≠/kJ·mol-1ΔG≠/kJ·mol-1ΔS≠/kJ·mol-13230.635×10-3328.527325.84299.0910.7023251.250×10-3328.527325.82597.8920.7013272.680×10-3328.527325.80896.4370.7013295.875×10-3328.527325.79294.8970.702

3.6 金属离子及化学试剂对褐藻胶裂解酶活力的影响

13种氯化物金属离子对AlgL活性的影响见表3. 终浓度为1 mmol·L-1时,Cu2+、 Cr3+、 Co2+、 Ba2+、 Sr2+、 Hg2+对该酶具有不同程度的抑制作用,Hg2+抑制作用最为明显； Ca2+、 Mg2+、 Zn2+、 Fe3+对该酶具有一定促进作用,但促进程度较低； 终浓度为5 mmol·L-1时,Cu2+、 Cr3+、 Co2+、 Ba2+、 Sr2+、 Hg2+、 Fe3+、 Ni2+、 Ca2+对该酶的抑制作用增强,在Hg2+作用下酶几乎完全失活.

表3 金属离子对AlgL活性的影响Tab.3 Effects of metal ions on AlgL activity

3.7 不同浓度NaCl对褐藻胶裂解酶活力的影响

由于本研究的褐藻胶裂解酶来自于海洋环境,因此分析了NaCl浓度对AlgL活力的影响. 结果表明,该酶在0～1 mol·L-1NaCl反应体系中,随着NaCl浓度升高,酶活力增大(相对酶活力达134.8%)； NaCl浓度继续升高,酶活力明显下降(见图7(a)). 盐耐受性实验表明,该酶在不同浓度(2、 3 mol·L-1) NaCl反应体系中保温2 h,酶活力保持在66%以上(见图7(b)),这可能与该酶产生菌的生存环境相适应.

图7 NaCl浓度对AlgL活力的影响Fig.7 Effects of NaCl on AlgL activity and stability

4 讨论

以Pseudoalteromonassp. zb7-4发酵制备褐藻胶裂解酶粗酶液,从中分离纯化出褐藻胶裂解酶AlgL,表观分子质量约为32 ku,其与海洋细菌来源的褐藻胶裂解酶性质相符[24]； 比活力为(208.26±5.87)U·mg-1,高于已报道孙丽萍等[25]从锈凹螺中分离纯化出的褐藻胶裂解酶(33.3 U·mg-1).

纯化酶AlgL的酶学性质研究表明： 该酶最适反应pH为7.0,最适反应温度为50 ℃,在pH 6.0～10.0、 40 ℃以下稳定性较好, 但AlgL在高于50 ℃时酶活力明显降低. 测定了其高温变性的热力学参数,计算发现该酶最不稳定肽段位于催化中心内部,表明温度对该酶的催化中心构象的稳定性具有十分显著的影响. 热力学参数反映的酶失活速率也体现出温度对酶活性的影响机理,即在较低温度下温度升高酶活性中心柔性加大,使对底物催化效率增加,但较高温度下(如325 K)活性中心构象由于柔性较高容易受高温作用失去作用于酶催化底物水解所需空间构型,从而导致酶热变性失活.

另外,研究了金属离子对AlgL活性的影响,发现Cu2+、 Cr3+、 Co2+、 Ba2+、 Sr2+、 Hg2+对该酶具有不同程度的抑制作用,Hg2+抑制作用最为明显； 但具有较好的耐盐性,对降解海藻废物再利用及开发生物能源有着重要意义[26]； 测定该酶对褐藻酸钠、 PG、 PM三种底物的酶促反应参数Km值、Vmax值、Kcat值表明,AlgL对PG具有很好的亲和力但对PM具有较高的催化效率,AlgL活性与底物亲和力大小并没有直接关系； 结构域预测发现AlgL具有典型的结合底物的CBM区域和催化中心域,通过本研究发现获得的AlgL的CBM片段与PG结合能力最好. 但另一方面,Kcat测定发现AlgL的催化中心结构域对PM的水解能力最高,这与Vibriosp. W13[27]来源的褐藻胶裂解酶表现出的动力学参数是相似的,这也为后续分子结构的改造奠定理论基础.

[1] FRANKLIN M J, CHITNIS C E, GACESA P,etal.PseudomonasaeruginosaAlgG is a polymer level alginate C5-mannuronan epimerase[J]. Journal of Bacteriology, 1994, 176(7): 1821-1830.

[2] 张玉娟, 罗福文, 姚子昂, 等. 海藻酸钠寡糖生物活性的研究进展[J]. 中国酿造, 2014, 33(1): 5-8.

[3] 祝玲, 程璐, 蔡俊鹏. 褐藻胶寡糖潜在药用价值的研究进展[J]. 中药材, 2006, 29(9): 993-996.

[4] AN Q D, ZHANG G L, WU H T,etal. Alginate-deriving oligosaccharide production by alginase from newly isolatedFlavobacteriumsp. LXA and its potential application in protection against pathogens[J]. Applied Microbiology, 2009, 106 (1): 161-170.

[5] IWAMOTO M, KURACHI M, NAKASHIMA T,etal. Structure-activity relationship of alginate oligosaccharides in the induction of cytokine production from RAW264.7 cells[J]. FEBS Lett, 2005, 579(20): 4423-4429.

[6] TUSI SK, KHALAJ L, ASHABI G,etal. Alginate oligosaccharide protects against endoplasmic reticulum-and mitochondrial-mediated apoptotic cell death and oxidative stress[J]. Biomaterials, 2011, 32(23): 5438-5458.

[7] 李丽研, 管华诗, 江晓路, 等. 海藻工具酶: 褐藻胶裂解酶研究进展[J]. 生物工程学报, 2011, 27(6): 838-845.

[8] ALKAWASH M A, SOOTHILL J S, SCHILLER N L. Alginate lyase enhances antibiotic killing of mucoid Pseudomonas aeruginosainbiofilms[J].APMIS, 2006, 114(2): 131-138.

[9]INOUEA,KAGAYAM,OJIMAT.PreparationofprotoplastsfromLaminariajaponicanativeandrecombinantabalonealginatelyases[J].JournalofAppliedPhycology, 2008, 20(5): 633-640.

[10]WANGYH,YUGL,WANGXM, et al.PurificationandcharacterizationofalginatelyasefrommarineVibriosp.YWA[J].ActaBiochimicaetBiophysicaSinica, 2006, 38(9): 633-638.

[11]HUX,JIANGX,HWANGHM, et al.PurificationandcharacterizationofanalginatelyasefrommarineBacteriumVibriosp.mutantstrain510-64[J].CurrentMicrobiology:anInternationalJournal, 2006, 53(2): 135-140.

[12]SWIFTSM,HUDGENSJW,HESELPOTHRD, et al.CharacterizationofAlgMsp:analginatelyasefromMicrobulbifersp. 6532A[J].PLoSOne, 2014, 9(11):e112939.

[13]ZHUY,WUL,CHENY.CharacterizationofanextracellularbiofunctionalalginatelyasefrommarineMicrobulbifersp.ALW1andantioxidantactivityofenzymatichydrolysates[J].MicrobiolRes, 2016, 182: 49-58.

[14]FARRELLEK,TIPTONPA.FunctionalcharacterizationofAlgL:analginatelyasefrompseudomonas aeruginosa[J].Biochemistry, 2012, 51(51): 10259-10266.

[15]ZHUBW,HUANGLS,TANHD.Characterizationofanewendo-typepolyM-specificalginatelyasefromPseudomonassp.[J].BiotechnolLett, 2015, 37(2): 409-415.

[16]OSTGAARDK,KNUTSENSH,DYRSETN, et al.ProductionandcharacterizationofguluronatelyasefromKlebsiella pneumoniaeforapplicationsinseaweedbiotechnology[J].EnzymeMicrobTechnol, 1993, 15(9): 756-763.

[17]HUANGL,ZHOUL,LIX, et al.CharacterizationofanewalginatelyasefromnewlyisolatedFlavobacteriumsp.S20[J].JournalofIndustrialMicrobiology&Amp(Biotechnology), 2013, 40(1): 113-122.

[18]ANQD,ZHANGGL,WUHT, et al.Propertiesofanalginate-degradingFlavobacteriumsp.strainLXAisolatedfromrottingalgaefromcoastalChina[J].CanadianJournalofMicrobiology, 2008, 54(4): 314-320.

[19] 李环, 陆佳平, 王登进.DNS法测定山楂片中还原糖含量的研究[J]. 食品工业科技, 2013,18: 75-77.

[20]DOUW,DANW,LIH, et al.PurificationandcharacterisationofabifunctionalalginatelyasefromnovelIsoptericola halotoleransCGMCC5336[J].CarbohydratePolymers, 2013, 98(2): 1476-1482.

[21] 侯保兵, 刘书来, 张建友, 等. 褐藻胶裂解酶产生菌的发酵优化研究[J]. 水产科学, 2009, 11(28): 667-670.

[22] 李建伟. 海洋细菌Pseudoalteromonassp.SM0524分泌的褐藻酸裂解酶的研究[D]. 济南: 山东大学, 2011: 40-41.

[23] 陈清西. 酶学及其研究技术[M]. 厦门: 厦门大学出版社, 2015: 135-145.

[24] 史翠娟, 闫培生, 赵瑞希, 等. 海洋微生物酶研究进展[J]. 生物技术进展, 2015, 5(3): 185-190.

[25] 孙丽萍,薛长湖,许家超,等. 锈凹螺褐藻胶裂解酶的分离纯化及酶学性质研究[J]. 中国水产科学,2004,11(3)： 266-270.

[26]TANGJC,TANIGUCHIH,CHUH, et al.Isolationandcharacterizationofalginate-degradingbacteriafordisposalofseaweedwastes[J].LettApplMicrobiol, 2009, 48(1): 38-43.

[27]ZHUB,TANH,QINY, et al.Characterizationofanewendo-typealginatelyasefromVibriosp.W13[J].InternationalJournalofBiologicalMacromolecules, 2015, 75: 330-337.