辐照对长江可培养微生物的影响及挑选指示微生物

宋家斑, 蒯琳萍

(上海交通大学核科学与工程学院,上海 200240)

0 引言

近年来,内陆核电建设已成为我国能源战略中一项重要的议程[1]. 但与滨海核电站相比,内陆核电站受纳水体容积较小,一旦发生泄漏事故,对当地居民的生产、 生活将产生极大影响,因此,内陆核电站低放废水排放标准比滨海核电站严格十倍[2]. 同时,为保证监测可靠,内陆核电需要更多科学评价标准[3]. 其中,生物监测可作为一项重要手段,更加客观地评价内陆核电站在正常运行、 事故工况以及退役过程中释放的放射性核素对环境产生的影响[4].

作为自然界中数量最多、 生物量最大、 对生命元素循环具有最大影响力的种群,微生物在用作水体环境监测上具有得天独厚的优势[5]. 相较于高等动物和植物,低等微生物对环境中出现的放射性物质、 重金属、 有机化合物等污染会表现得更加敏感,它们能够最快感受到生态系统中环境质量的变化,并通过相关机制做出对应反应. 因此,微生物被认为是最有潜力的指示生物[6].

目前,在重金属、 农药等一系列污染领域中,将微生物作为污染指示生物的相关研究已经取得了令人瞩目的成就[7]. 但在放射性污染领域,尚未出现选用微生物进行生物监测的研究报道. 本研究通过对比长江水样辐照前后可培养微生物出现的变化情况,探讨辐照对微生物种群结构的影响； 同时,寻找水体中具有指示价值的微生物,为长江流域放射性污染的生物监测提供相关参考依据.

1 材料与方法

1.1 水样采集

于2016年6月1日对长江流域三个点位进行水样采集,采样点位置如图1所示. 用有机玻璃采样器采集各点位水面之下0.5 m处的水样,充分混合后,装入事先经过湿热灭菌的塑料瓶中,放入保温箱内,立即送往上海市计量测试技术研究院对样品进行辐照.

图1 样品采集点位示意Fig.1 Location of sampling sites

1.2 样品辐照

样品辐照： 采用60Co源对样品进行辐照,剂量分别为2、 20、 200 Gy,并取一组没有经过辐照的水样作为空白对照.

1.3 分析方法

1) 样品中细菌的计数[8]. 样品经稀释后涂布在R2A琼脂平板上,每组样品设置3个平行对照,30 ℃培养. 每日观察菌落形态, 进行群落统计,根据菌落尺寸、 颜色、 隆起情况、 边缘形状来区分不同种类菌种.

2) 单菌种生理生化功能测定. 将R2A平板上培养得到的菌株转接出来,纯化3次,参照《常见细菌系统鉴定手册》[9]对单菌种进行生理生化功能实验,初步鉴定其种属信息.

3) 单菌种分子生物学鉴定. 将菌种送往上海派森诺生物科技股份有限公司进行DNA提取、 PCR扩增及序列测定,确定细菌种属.

4) 群落多样性分析[10]. 群落多样性用丰度(S)、 优势度(P)、 Simpson指数(L)和Shannon-Wiener指数(H)4个群落多样性指数表征.

(1)

(2)

(3)

其中： S表示样品中所含的不同形态特征的菌落种类数； P表示某一类型菌种所占比例； L表示样品中随机挑选的两个菌落为同一类型菌种的概率,L越小,表示种群分布越均匀,种群越丰富； H是能够反映群落均匀度和多样性的复合指标,H越大,则表明生物多样性越高.

5) 相关性分析. 使用软件OriginLab9.0对不同辐照剂量下,细菌总数及单菌种数量的改变情况进行曲线拟合,了解辐照强度与菌种数量改变之间的相关性.

2 结果与分析

2.1 分离菌种鉴定

从水体中共分离出了18种菌落类型,分别命名为a～r. 对所有的18类菌落分别进行生理生化实验(见表1)及分子生物学鉴定(见表2),通过与NCBIribosomalRNAsequence数据库中的数据进行比对,将序列相似度最大的菌种认定为鉴定结果. 可以发现分离得到的菌落属于多个不同种属,其中,属于黄杆菌属(Flavobacterium)的菌种有4种,芽孢杆菌属(Bacillus)、 鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)以及不动杆菌属(Acinetobacter)各2种,其余各属各有一种.

表1 菌种生理生化特征Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of strains

注： “+”表示阳性,“-”表示阴性

表2 菌种鉴定结果Tab.2 Bacterial identification results

2.2 辐照对微生物数量的影响

统计经辐照后平板上各形态菌落的数量,各辐照强度下细菌的群落组成如表3所示. 可以看到,随着辐照剂量的提高,培养得到的微生物数量呈现递减趋势,可培养细菌数量从对照组的2.35×104CFU·mL-1降到了200 Gy辐照强度下的6.8×103CFU·mL-1,降幅达到71.67%,表明高强度的辐照会使大部分微生物失活,Krisko等[11]的实验也得出了类似结论. 当辐照剂量为2 Gy时,可培养细菌数量为2.21×104CFU·mL-1,与对照组差异不大,表明该辐照剂量不会对微生物造成太大的影响.

表3 不同辐照强度下样品中细菌的群落组成Tab.3 Flora composition of bacteria in the different irradiance samples

2.3 辐照对微生物种群结构的影响

表4 不同辐照强度下样品中的群落多样性Tab.4 Community diversity in the different irradiance samples

由表3分析结果知,当辐照剂量为2 Gy时,群落结构基本没有改变,说明该剂量的辐照对微生物影响很小,此结果与辐照对数量的影响相一致. 随辐照强度的增加,可培养细菌种类反而增加了4种,该结果是由于辐照使得较为敏感的优势菌种大量死亡,其余辐照耐性较强的菌种获得了足够的生长空间所致. Simpson指数(L)随辐照剂量的增加而下降(见表4),也印证了随辐照强度增加可培

图2 不同辐照强度下样品中各菌属比例分布Fig.2 Proportion of the genus in the different irradiance samples

养微生物种群变得更丰富、 种群分布变得更加均匀的结论,El-Sayed等[12]的研究中也出现了类似现象. 分析样品中各菌属比例随辐照强度的改变情况(见图2),结果表明： 黄杆菌属(Flavobacterium)细菌在各组中所占比例最高,是优势菌属； 随辐照强度的增加,黄杆菌属(Flavobacterium)的比例从58.29%降到了29.31%,受辐照影响大； 相较而言,芽孢杆菌属(Bacillus)的比例从对照组的3.35%上升到200 Gy组的19.12%,表明该属细菌对辐照具有高耐受性.

2.4 辐照对单菌种的影响

菌种d(Flavobacteriumnitratireducensstrain N1)数量的变化趋势(见图3)与可培养细菌总数的变化趋势(见图4)相类似. 样品中菌种的组成情况(见表3)表明： 随着辐照剂量的增加,该菌种所占比例从对照组的40.43%降至200 Gy组的16.18%,且细菌总数下降了88.42%,说明该菌种的辐照敏感度高； 同时,该菌种是水体中的优势菌种. 因此可认为,菌种d(Flavobacteriumnitratireducensstrain N1)有作为长江流域放射性污染指示生物的价值.

图3 不同辐照剂量下菌种d数量的变化情况Fig.3 Variation of strain d under different irradiation doses

图4 不同辐照剂量下可培养细菌总数的变化情况Fig.4 Variation of total bacteria under different irradiation doses

3 讨论

目前,国内外关于辐照对微生物影响的研究[13-14]中,大多选用kGy剂量进行辐照； 而本实验采用Gy量级进行辐照,多数微生物也出现了较高的辐照致死率. 主要是由于本实验的辐照样本为自然水体,可培养微生物浓度只有2.35×104CFU·mL-1,其他实验则是选取经过富集培养后的菌悬液作为研究对象,可培养微生物浓度大致为106～107CFU·mL-1. 相关研究表明[15],初始含菌量越高,辐照对微生物产生的影响就越小. 此外,本实验选用塑料容器,相比于Mahmoud等[14]使用的玻璃试管来说,塑料容器密度较小,原子序数比玻璃低,辐射的透过性较好.

微生物主要通过快速修复受损的DNA片段、 形成芽孢减缓新陈代谢速率、 产生超氧化物歧化酶清除自由基等途径来降低辐照损伤. 实验中提到的芽孢菌属(Bacillus)细菌能在不良生存条件下通过产生芽孢的形式减少水分含量、 减缓代谢速度来降低辐照所造成的伤害,因此具有较强的辐照耐受性. 同时,Zhi[16]发现,革兰氏阳性菌要比革兰氏阴性菌耐辐照； 吴江等[17]研究得出好氧微生物的超氧化物歧化酶含量要高于兼性厌氧微生物.

实验挑选出的菌种d(Flavobacteriumnitratireducensstrain N1)属于兼性厌氧的无芽孢革兰氏阴性菌,所以相比其他分离菌种,它对辐照更加敏感. 同时,菌种d属于黄杆菌属,Cousin 等[18]总结了该菌属的分布情况,得出该类细菌广泛的存在于自然水体中. 因此该菌种有作为长江水体放射性污染指示生物的价值.

目前相关方向的研究主要侧重于辐照对单菌种的影响,以期获得耐辐照菌种或了解辐照产生的致死率等信息,如Lee等[19]对大肠杆菌、 蜡状芽孢杆菌等菌种辐照致死剂量的研究； Rainey等[20]对耐辐照菌种的挑选. 本研究则将重点放在辐照对环境水体中可培养微生物的整体影响上,探究辐照引发微生物种群结构的变化情况. 同时,寻找水体中具有指示价值的微生物,为长江流域放射性污染的生物监测提供相关参考依据.

[1] 宋明强. 中国内陆核电发展必要性分析[J]. 科技创新与应用, 2012 (27): 178.

[2] 郭欣伟, 谭炳卿, 赵静, 等. 内陆核电对地表水水质影响的初步分析[J]. 水利科技与经济, 2013, 19(4): 5-9.

[3] BERESFORD N A, HOSSEINI A, BROWN J E,etal. Assessment of risk to wildlife from ionising radiation: can initial screening tiers be used with a high level of confidence[J]. Journal of Radiological Protection, 2010, 30(2): 265-284.

[4] COPPLESTONE D, BERESFORD N A, BROWN J E,etal. An international database of radionuclide concentration ratios for wildlife: development and uses[J]. Journal of Environmental Radioactivity, 2013, 126(4): 288-298.

[5] AZARBAD H, NIKLINSKA M, VAN GESTEL C A M,etal. Microbial community structure and functioning along metal pollution gradients[J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2013, 32(9): 1992-2002.

[6] IBEKWE A M, GRIEVE C M. Changes in developing plant microbial community structure as affected by contaminated water[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2004, 48(2): 239-248.

[7] 郑雅楠, 王淑莹, 郭建华, 等. 利用微型生物指示评价污水处理厂运行的研究进展[J]. 微生物学通报, 2008, 35(12): 1943-1949.

[8] 赵斌, 林会, 何绍江. 微生物学实验[M]. 2版. 北京： 科学出版社, 2014.

[9] 东秀珠, 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京： 科学出版社, 2001.

[10] EDWARDS M L, LILLEY A K, TIMMS-WILSON T H,etal. Characterisation of the culturable heterotrophic bacterial community in a small eutrophic lake (PriestPot)[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2001, 35(3): 295-304.

[11] KRISKO A, RADMAN M. Protein damage and death by radiation inEscherichiacoliandDeinococcusradiodurans[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2010, 107(32): 14373-14377.

[12] EL-SAYED W S, GHANEM S. Bacterial community structure change induced by gamma irradiation in hydrocarbon contaminated and uncontaminated soils revealed by PCR-denaturing gradient gel electrophoresis[J]. Biotechnology, 2009, 8(1): 78-85.

[13] 丘苑新, 叶盛英, 余恺. 大肠杆菌及乳酸杆菌的辐射致死机理初探[J]. 食品科技, 2007(6): 38-41.

[14] MAHMONUD B S M, BACHMAN G, LINTON R H. Inactivation ofEscherichiacoliO157:H7,Listeriamonocytogenes,SalmonellaentericaandShigellaflexnerion spinach leaves by X-ray[J]. Food Microbiology, 2010, 27(1): 24-28.

[15] 魏敏, 杨平华, 黎青, 等. 影响食品辐照灭菌效果的主要因素[J]. 四川农业科技, 2010 (3): 54-55.

[16] ZHI Q Y. New food sterilization technology[M]. Tokyo: Agricultural Press, 2006.

[17] 吴江, 陈代杰. 微生物中超氧化物歧化酶含量及分布[J]. 中国医药工业杂志, 1997, 28(11): 495-498.

[18] COUSIN S, PAUKER O, STACKEBRANDT E.Flavobacteriumaquidurensesp. nov. andFlavobacteriumhercyniumsp. nov., from a hard-water creek[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2007, 57(2): 243-249.

[19] LEE N Y, JO C, SHIN D H,etal. Effect ofγ-irradiation on pathogens inoculated into ready-to-use vegetables[J]. Food Microbiology, 2006, 23(7): 649-656.

[20] RAINEY F A, RAY K, FERREIRA M,etal. Extensive diversity of ionizing-radiation-resistant bacteria recovered from Sonoran desert soil and description of nine new species of the genus deinococcus obtained from a single soil sample[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(9): 5225-5235.