发酵鸡血中优良菌株的筛选与鉴定

梁肖娜，叶青，吴尚，吴尚仪，关博元，康世墨，陶冬冰，岳喜庆，*

（沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳110866）

鸡血是鸡肉屠宰加工过程中的主要副产物之一，约占鸡质量的4%～9.7%。我国的鸡血资源丰富，但是利用率较低，大部分鸡血被作为废弃物倒掉，只有少部分被加工成血豆腐、血肠等传统食品或被加工成饲料、血粉等产品[1]。据调查研究显示，畜禽类血液尤其是鸡血营养价值较高，并且是一种含有营养价值较高的蛋白质来源，鸡血的蛋白质含量高达16%～18%，其中含有18种氨基酸，有8种为人体生长所必需的氨基酸。此外，鸡血中还含有丰富的维生素和生物酶类，以及丰富的氮、磷、钾、钙、镁等矿物质，其营养价值丰富、全面[2]。

由于目前在我国鸡血资源较少的被得到开发和利用，大部分的鸡血倒入到田地中被自然发酵，导致大量的鸡血资源的流失，这不仅对我国现有的资源造成巨大的浪费，同时也给鸡血资源充分开发和利用到其他方面造成不良的影响和效果[3-4]。本实验从微生物学角度出发，并结合生产实际，以新鲜的鸡血为原料，进行常温下自然发酵，利用微生物培养和发酵技术，从霉变的鸡血中分离筛选出优势的有益微生物菌株[5]，并且对菌株进行鉴定研究，利用优势菌株发酵鸡血液体肥料，后期对鸡血液体肥料的肥效进行研究。这不仅对于鸡血资源的开发利用做出了一定的贡献，并且也为鸡血资源更好地应用于食品、饲料、肥料等方面奠定了坚实的理论基础，同时也为其他动物血液的生产应用提供了潜在的科研价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜鸡血（自然条件下微生物状态）：沈阳市伟峰肉鸡加工厂；牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠、蔗糖、七水硫酸镁、硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸亚铁：国药集团化学试剂有限公司；DNA提取试剂盒、蛋白酶K、脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleotide triphosphate，dNTP）、10×PCRbuffer、r-Taq 酶、Loadingbuffer、MarkerDM2000、Gel-red核酸染料、引物：北京鼎国昌盛生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅：郑州南北仪器设备有限公司；HZQ-F160全温振荡培养箱：太仓市豪成实验仪器制造有限公司；SW-CJ-2F型双人双面净化工作台：苏州净化设备有限公司；BPS-250培养箱：上海梅颖浦仪表制造有限公司；BL-500电子天平：上海亚津电子科技有限公司；OLYMPUS CX21显微镜：上海优浦科学仪器有限公司；722G可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；PCR扩增仪、凝胶成像系统：美国伯乐公司；TDL-SA离心机：上海菲恰尔分析仪器有限公司。

1.3 培养基

肉膏蛋白胨培养基；孟加拉红琼脂培养基；马铃薯（PDA）培养基；改良察式培养基；干酪素培养基。

1.4 试验方法

1.4.1 菌种初步分离与筛选[6-7]

将新鲜鸡血置于无菌状态下，室温自然发酵30 d，采用10倍梯度稀释法将霉变鸡血分别涂布于细菌、霉菌分离培养基平板上（细菌37℃下培养、霉菌30℃下培养），待长出菌落后，分别从中挑取生长旺盛的单个菌株，进行反复分离纯化至第三代，最终得到纯种菌株并保存备用。再挑取上述纯种菌株中生长旺盛的单个菌株，分别接种到以2%的鸡血代替硝酸钠作为唯一氮源的改良察式培养基平板上，在适宜温度条件下培养，并反复分离纯化直至得到纯种菌株，初步观察菌落形态并分类。将细菌和霉菌分别编为A、B两组，将上述获得纯种菌株接种到干酪素培养基平板上，分别培养至30 h、60 h，并测量其透明圈直径和菌落直径的比值（DC），根据水解透明圈与菌落直径的比值（DC）的大小可以初步判断菌株蛋白酶活力的大小，最终分离纯化在30 h、60 h时DC值较大的菌株，并且在0℃冰箱中保存备用。

1.4.2 菌种发酵复筛选[8]

经透明圈初筛后得到的细菌、霉菌菌株，各取一接种环量接种到灭菌的鸡血中，在160 r/min条件下，摇床培养180 h（细菌37℃、霉菌30℃），测定蛋白质含量、可溶性蛋白质含量、氨基酸态氮含量，比较分析测定指标，筛选出发酵鸡血的优势菌株[9]。

1.4.3 菌株形态初步观察与鉴定

观察菌落的形状、颜色、透明度等各项形态特征，细菌和霉菌分别通过革兰氏染色、小室培养法在显微镜下进行观察，并对照《伯杰细菌鉴定手册》和《真菌鉴定手册》，进行初步鉴定菌属。

1.4.4 菌株DNA的提取和浓度测定

将四种菌株摇床培养至对数期，11 000 r/min离心15 min，弃去上清液，加无菌生理盐水进行重悬，反复吹打液体，重复3次以上操作，并收集菌液。试验采用单菌落裂解法制备模板DNA，每个菌株提取3次，用微量紫外-分光光度计测定DNA质量浓度和在A260nm/A280nm下的光度值，光度值可以表示所提取DNA的纯度，在Nucleic Acid的检测良好的状态下，用灭菌的蒸馏水进行多次零点校正，校正之后开始测定样品DNA的浓度，每次进样量为2 μL。将A260nm/A280nm在1.8～2.0范围内的DNA样品进行PCR扩增[10]。

1.4.5 菌株PCR扩增

1.4.5.1 细菌DNA的扩增[11]

试验以提取细菌的DNA为模板，细菌的16SrDNA采用PCR进行扩增，扩增片段约为1 500 bp，上游引物为 27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物为 1492R：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。PCR 扩增体系（50 μL）为：1.0 μL 的 DNA 模板，39.0 μL ddH2O、5.0 μL 10×PCR buffer、1.0 μL 2.5mmol/L dNTPs、上下游引物各1.5 μL、DNA Taq 酶 1.0 μL。PCR 反应参数为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min 30 s；72℃7 min；35个循环。反应完成后，取3 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测回收，在1 500 bp处有清晰条带后方可送出去检测，测序由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。

1.4.5.2 真菌DNA的扩增[12]

试验以提取霉菌的DNA为模板，霉菌的28SrDNA采用PCR进行扩增，扩增片段约为600bp，上游引物为 ITS1：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′；下游引 物 为 IS4：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′），PCR 扩增体系（50 μL）为，1.0 μL 的 DNA 模板，39.0 μL ddH2O、5.0 μL 10×PCR buffer、1.0 μL 2.5 mmol/L dNTPs、上下游引物各1.5 μL、DNA Taq 酶 1.0 μL。PCR 反应参数为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min 30 s；72℃7 min；35个循环。反应完成后，取3 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测回收，在600 bp处有清晰条带后方可送出去检测，测序由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。

1.4.6 细菌和真菌同源性分析及系统发育树的构建

通过连接互联网，将所检测到的序列提交到NCBI（美国国立生物技术中心）数据库，利用BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）分析工具，将所分离得到的细菌的16SrDNA序列和霉菌28SrDNA序列与GenBank/EMBL/DDBJ数据库中已建立的16SrDNA序列和28SrDNA进行相似性的比较分析，找到与已知目的基因序列同源性最高的已知菌种，再从GenBank/EMBL/DDBJ的数据库中，提取数据库中已知的标准菌株的基因序列和分离菌株的序列，用ClustalX2.1软件进行校准排齐，用MEGA5.0软件绘制系统发育树。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离与筛选

从细菌、霉菌平板培养基分别获得细菌60株和霉菌30株，经过反复分离纯化后，保存备用。将上述获得共90株菌株，分别挑一接种环，接种到以2%鸡血为唯一氮源平板培养基上培养，获得生长旺盛的细菌32株，霉菌生长旺盛的菌株18株，再将其接种到干酪素平板培养基上，获得有生长透明圈的细菌15株，霉菌8株，分别培养至30、60 h测定其透明圈直径和菌落直径，计算两者比值（DC值），各菌株在30、60 h生长以及透明圈大小情况如表1所示。

如表1所示，细菌和霉菌在30、60 h的透明圈直径和菌落直径以及透明圈直径和菌落直径比值（DC）可以看出，细菌A5、A7、A8菌株的产蛋白酶能力较强，DC值均在2以上；霉菌B1、B3、B4菌株的产蛋白酶能力较强，DC值均在1.5以上。

2.2 优势菌株的复筛选

鸡血中蛋白质含量的测定如图1所示。

表1 培养30、60 h后各菌株生长以及透明圈大小Table 1 The growth of strains 30、60 h and size of transparency

图1 鸡血中蛋白质含量的测定Fig.1 Determination of protein content in chicken blood

如图1所示用菌株发酵后鸡血的蛋白质含量与对照组相比，两组间数据差异非常显著（P≤0.01），说明优势菌株的添加可以显著增加鸡血中蛋白质的含量，细菌A5与A7、A8之间相比差异非常显著（P≤0.01），而细菌A7与A8相比，没有统计学显著性差异（P＞0.05）；霉菌B1与B4之间相比有显著性差异（P≤0.05），B3与B4相比存在统计学差异（P≤0.05），B1与B3相比差异不显著（P＞0.05）。

鸡血中可溶性蛋白质含量的测定如图2所示。

图2 鸡血中可溶性蛋白质含量的测定Fig.2 Determination of soluble protein content in chicken blood

如图2所示，发酵后鸡血的可溶性蛋白质含量与对照组相比，两组间数据差异极显著（P≤0.01），说明添加优势菌株可以使鸡血中可溶性蛋白质的含量上升，细菌A5与A7、A8之间相比数据统计学存在显著性差异（P≤0.01），A7、A8 差异不显著（P＞0.05），霉菌B1、B3和B4之间差异极显著（P≤0.01）。

鸡血中氨基酸态氮含量的测定如图3所示。

图3 鸡血中氨基酸态氮含量的测定Fig.3 Determination of amino acid nitrogen content in chicken blood

如图3所示，发酵后的鸡血和发酵前鸡血中氨基酸态氮含量相比较，两组数据之间存在统计学显著性差异（P≤0.01），其中 A5与 A7差异不显著（P＞0.05）与A8之间差异显著（P≤0.05），而 A7、A8之间存在显著性差异（P≤0.05）；霉菌 B1、B3、B4之间差异极显著（P≤0.01）。综合以上分析比较可以得出，细菌A7、A8和霉菌B1、B4为鸡血发酵的优势菌株。

2.3 优势菌株菌落形态观察

菌落形态学特征主要包括菌落形状、菌落颜色、菌落透明度菌落质地等，细菌A7、A8经革兰氏染色、过氧化氢和V.P.试验均为阳性，菌株在平板上的单菌落呈现乳白色，圆形，边缘整齐光滑，稍微透明，菌落直径约为1 cm，负染色并在显微镜下观察（图4中A7、A8），均为粗壮的短杆状，周生鞭毛，根据《伯杰细菌鉴定手册》和显微镜观察，初步判断A7、A8为巨型杆菌。霉菌采用小室培养法进行培养观察，霉菌B1为灰绿色，表面光滑，其菌落呈现大而疏松的棉絮状，在显微镜下观察产生假菌丝（图4中B1），形成子囊和子囊孢子，分生孢子为球形；霉菌B4质地丝绒状或稍带絮状，菌落反面略带黄色，表面平坦，在边缘有时具白色的菌丝体，在显微镜下观察分生孢子球形或近球形（图4中B4），依据《中国真菌杂志》、《真菌鉴定手册》，初步判定B1、B4分别为青霉和曲霉。

图4 细菌和霉菌显微镜图片Fig.4 Microscopic pictures of bacteria and fungi

2.4 菌株DNA浓度检测和提取结果

如表2所示，细菌A7、A8，霉菌B1、B4的DNA质量浓度均保持在30 ng/μL以上，并且4种菌株A260nm/A280nm下的光度值，也都均保持在1.8～2.0之间的范围内，因此可进行PCR扩增。

表2 4种菌株DNA浓度和纯度结果Table 2 Results DNA concentration and purity of four strains

2.5 PCR扩增结果

试验分别以两株细菌和真菌的DNA作为模板，在PCR扩增仪上进行PCR扩增反应，反应完成后，取3 μL PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测，确认PCR扩增的片段。细菌和霉菌所扩增的片段长度分别在 1 500 bp（5a）和 600 bp（5b），说明 PCR 扩增成功，可以进行序列测定。

2.6 细菌16SrDNA和霉菌28SrDNA序列同源性分析和系统发育树构建

细菌16SrDNA和霉菌28SrDNA同源性分析结果如表3所示。

由表3可知，本实验筛选出的两株细菌和霉菌与标准菌株的同源性均达到97%以上，其中A7与标准菌株的同源性达到了100%，因此基本可以确定A7属于芽孢杆菌菌属（Bacillus）；另外有两株菌株与标准菌株的同源性达到了99%，基本可以确定这两株属于青霉菌属（Penicillium）和曲霉菌属（Aspergillus），分别是B1和B4；A8与标准菌株的同源性达到了97%，基本可以确定A8是属于希瓦氏菌属（Shewanella）。

图5 细菌和真菌PCR扩增结果Fig.5 PCR amplification results of DNA extracted from the bacteria and mould strains

图6为细菌根据16SrDNA，霉菌根据28SrDNA所建立的系统发育树。

表3 细菌16SrDNA和霉菌28SrDNA同源性分析结果Table 3 Homological analysis of bacteria and mould by 16Sr DNA and 28Sr DNA sequence

从图中可以看出，A7属于芽孢杆菌菌属，被鉴定为 Bacillus thuringiensis；B1、B4 属于霉菌菌属，B1 被鉴定为Penicillium citreonigrum，B4被鉴定为Aspergillus tubingensis；A8属于希瓦氏菌属，被鉴定为Shewanella sp.。本实验采用生理生化对该4种菌株进行初步鉴定，并结合上述对于细菌16SrDNA和霉菌28SrDNA序列鉴定和同源性分析比对，这与表3中的同源性分析比对结果是一致的，因此可以判断细菌A7、A8分别为苏云金芽孢杆菌和希瓦氏菌；霉菌B1、B4分别为青霉菌属、塔宾曲霉。

图6 细菌16SrDNA（a）和霉菌28SrDNA（b）建立的系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree of bacteria and mould established on the basis of 26SrDNA and 28Sr DNA sequence analysis

3 结论

本实验利用现代化的微生物技术对自然发酵鸡血进行微生物的培养、分离、纯化，成功地筛选出细菌60株、霉菌30株，再经过透明圈试验、蛋白质含量、氨基酸态氮含量、可溶性蛋白质含量筛选指标对90株菌株进行综合比较分析，最终筛选出一组发酵鸡血的优势菌株为细菌A7、A8，霉菌B1、B4，并通过形态学鉴定、显微镜观察以及16SrDNA和28SrDNA对优势菌株进行分子鉴定，经同源性分析比对，最终得出细菌A7属于芽孢杆菌菌属，被鉴定为Bacillus thuringiensis，A8是属于希瓦氏菌属，被鉴定为Shewanella sp.；霉菌B1、B4属于霉菌菌属，B1被鉴定为Penicillium citre－onigrum，B4被鉴定为Aspergillus tubingensis。随着人们生活水平的提高，对畜产品的需求量急剧增加，与此同时，国家和社会对于环境的要求也随之提高，而养殖场的废弃物的循环加工和再利用，也成为近年来研究的热门话题之一。本实验的研究和开展将会对提高鸡血的综合利用价值和后续的开发利用提供充分的理论依据和奠定坚实的基础。

[1]王文婷,侯成立,宋璇,等.动物血浆蛋白水解物功能及应用研究进展[J].食品科学,2017(7):309-314

[2]杨葆春,靳义超,李全,等.动物血液资源的开发利用研究进展[J].青海畜牧兽医杂志,2011(5):44-46

[3]GREENBERG J A,DIMENNA M,HANELT B,et al.Analysis of postblood meal flight distances in mosquitoes utilizing zoo animal blood meals[J].Journal of Vector Ecology,2012,37：83-89

[4]VUDATHALA D,CUMMINGS M,MURPHY L.Analysis of Multiple Anticoagulant Rodenticides in Animal Blood and Liver Tissue Using Principles of QuEChERS Method[J].Journal of Analytical Toxicology,2010,34：273-279

[5]赵晓丹,郭春华,柏雪,等.微生物发酵牛血生产蛋白饲料的研究[J].生物学通报,2016(4):45-49

[6]刘仲敏,何伯安,曹友声,等.猪、牛血固态发酵生产蛋白质饲料的研究[J].微生物学通报,1995(6):351-354

[7]DONG M,JIANG X,JIANG H,et al.Studies on screening,identification and fermentation characteristics of new natto-producing strain with the strong fibrinolytic activity[J].Journal of Nanjing Agricultural University,2001,24(1):95-98

[8]鲁云风,杨柯金,梁子安,等.响应面分析法优化菌株B10发酵牛血条件的研究[J].饲料广角,2010(21):29-31,40

[9]MISSOTTEN J A M,GORIS J,MICHIELS J,et al Screening of isolated lactic acid bacteria as potential beneficial strains for fermented liquid pig feed production[J].Animal Feed Science&Technology,2009,150：122-138

[10]武俊瑞,岳喜庆,石璞,等.PCR-DGGE分析东北自然发酵酸菜中乳酸菌多样性[J].食品与生物技术学报,2014,33(2):127-130

[11]孙慧君,张颖,王洪玉,等.传统发酵锦州小菜中主要微生物多样性分析[J].食品科学,2017(2):15-19

[12]孟令帅,张颖,邹婷婷,等.辣白菜中乳酸菌的分离鉴定[J].食品科学,2015(11):130-133