热变性乳清浓缩蛋白与高甲氧基果胶混合体系相分离行为的研究

曹传爱，吴鑫本，贾惜文，赵神彳，张帅，刘骞，*

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030；2.虎林出入境检验检疫局，黑龙江虎林158400）

天然高分子包括蛋白质、多糖等亲水性胶体，由于良好的乳化性、稳定性、持水性等性能，广泛应用在食品工业、制药行业以及生物技术行业。但是由于种类有限、化学结构相对单一，在食品物性设计中可利用的选择较少，无法满足对食品精细结构、质地多样、口感独特以及功能性的需求[1]，因此出现多种天然高分子物质复合使用的方法。当两种或多种天然高分子物质混合后，由于热力学不相容性使体系发生相分离成为一种较为普遍的现象[2]。在食品的加工和储藏过程中，相分离行为造成食品体系不稳定。但是有些研究需要利用相分离行为制备特殊的质地和结构，达到丰富食品微结构和物性的目的。因此研究高分子混合体系的复杂相分离行为具有重要的理论和应用前景。在适当条件下两种及以上天然高分子物质混合可产生不同类型的相分离行为[3]，分为隔离型相分离和结合型相分离两种。隔离型相分离的两相中分别富含一种高分子物质，由携带相同电荷的高分子间的静电排斥作用或是不带电荷的高分子之间的热力学不平衡而引起[4-5]。结合型相分离是由于高分子携带相反电荷形成的，主要的推动力是静电库仑力，使得一相中富含两种高分子物质，另一相中几乎为溶剂[5-6]。

研究发现，蛋白与多糖混合体系之间存在明显相分离行为。Grinberg等[7]研究了不同类型的多糖与蛋白质的热力学不相容性，不同类型多糖热力学不相容性的大小顺序为：羧基多糖＞中性多糖＞硫酸基多糖，线性多糖与支链多糖相比，易发生相分离行为。Tuinier等[8]研究发现，当酪蛋白/果胶混合体系的pH＜5时，因果胶与酪蛋白带相同电荷产生静电相互作用，使果胶在酪蛋白胶粒表面发生多层吸附；当体系pH＞5时，果胶与酪蛋白由于热力学不相容性出现相分离现象。乳清蛋白是以球蛋白的形式存在于乳中，约占总蛋白的20%，具有凝胶性、乳化性、起泡性等特点[9]。乳清浓缩蛋白（Whey Protein Concentrate,WPC）是从巴氏杀菌的乳清中尽量去除非蛋白质成分得到的，蛋白质含量约占34%～82%[10]。研究发现，加热处理乳清蛋白会使球状蛋白部分地展开，暴露出更多埋藏在分子内的疏水基团和巯基，然而加热过程中蛋白容易变性导致蛋白聚集，使其功能性质受到限制，影响其在食品工业中的应用[11]。果胶是一种天然阴离子多糖，存在于植物的初生细胞壁和中间层中。通常将酯化度（Degree of Esterification，DE）高于50%的果胶称之为高甲氧基果胶（High-methoxylPectin，HM-P），反之低于 50%的为低甲氧基果胶。因果胶具有良好的胶凝、增稠性能，已被广泛应用于食品工业中。目前关于蛋白/多糖混合体系相行为的研究已有不少报道，大多数研究提出利用相分离行为进行新型食品微结构的设计，如填充水凝胶的制备[12]、保护不稳定功能因子的多层乳液的制备[13]和缓释技术[14]等，然而关于热变性乳清蛋白（HeatDenaturedWheyProteinConcentrate，HD-WPC）与果胶混合体系相分离行为研究较少。另外影响相分离的因素包括混合比例、温度、浓度、离子强度、pH值等，通过改善各种因素对混合体系复杂的相行为的影响，可以帮助我们得到理想的产品微结构和物性。

因此，本实验主要研究热变性乳清浓缩蛋白与高甲氧基果胶以不同质量比（1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1）混合后整个混合体系的相分离行为。分析探讨混合体系中上相与下相中的蛋白和多糖含量、混合体系表观黏度以及外观的变化趋势，为后续在水凝胶中的研究奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳清浓缩蛋白（WPC，80%）：北京银河路商贸有限责任公司；高甲氧基果胶：上海源叶生物科技有限公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠：天津市巴斯夫化工有限公司；盐酸磷酸浓硫酸：哈尔滨市万太生物药品公司；叠氮钠、罗丹明B、考马斯亮蓝G-250、苯酚均为分析纯；试验中所用的水均为超纯水。

1.2 仪器与设备

JD500-2电子天平：沈阳龙腾电子称量仪器有限公司；AL-104型精密电子天平、FE20K型pH计上海梅特勒-托利多仪器设备有限公司；DK-8B电热恒温水浴锅：上海惊宏实验设备有限公司；GL-21M冷冻离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；TU-1800紫外可见光分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；TA流变仪Discovery DHR-1：美国TA仪器公司。

1.3 试验方法

1.3.1 溶液的制备

HD-WPC溶液的制备：称取一定量的乳清浓缩蛋白粉末分散于pH=7.0的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液中，于室温下用磁力搅拌器1 000 r/min下搅拌1 h使其充分溶解，用4 mol/L NaOH调至pH=7.0，配制成30 mg/mL的蛋白分散液。将制得的蛋白分散液在85℃下水浴加热30 min，热处理后，立刻冰浴冷却到室温。然后在7 500 r/min下离心2 h，去除不溶物。4℃下贮藏。同时加入0.02%的叠氮钠。

HM-P溶液的制备：称取一定量的HM-P粉末溶解于pH=7.0的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液中，室温下1 000 r/min下搅拌1 h，用4 mol/L NaOH调至pH=7.0，制得浓度为30 mg/mL HM-P溶液，4℃下贮藏过夜水合。同时加入0.02%的叠氮钠。

1.3.2 相分离体系的制备

将初始浓度30 mg/mL HD-WPC溶液和初始浓度 30 mg/mL HM-P 溶液按照 1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1、5∶1质量比混合，用1 mol/L HCI或1 mol/L NaOH调至pH=7.0，于室温下用磁力搅拌器1 000 r/min下搅拌30 min。将样品等体积分为两份。其中一份加入浓度为0.05%罗丹明B溶液，加入量为5 μg/g混合物，混合均匀。未加罗丹明B的样品和加罗丹明B的样品在20℃，7 500 r/min下离心2 h。混合物分为明显的两相。

1.3.3 样品蛋白量的测定

参照Bradford等[15]的方法测定样品蛋白含量。采用考马斯亮蓝的方法进行测定，用牛血清白蛋白进行蛋白标准曲线的测定，在595 nm处测量吸光度。以蛋白质含量（mg）为横坐标、A595为纵坐标，绘制单边标准曲线。最后进行样品蛋白的测定，对样品进行稀释样品，按上述方法测定吸光度，计算样品溶液的蛋白含量。

1.3.4 样品多糖含量的测定

参照Dubois等[16]的方法测定样品多糖含量。用葡萄糖标准溶液进行多糖标准曲线的制备，于490nm处测定吸光度，以葡萄糖含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制多糖标准曲线。然后进行样品多糖含量的测定，将样品进行适度稀释，按照上述方法测定吸光值，计算样品多糖含量。

1.3.5 表观黏度的测定

使用动态剪切流变仪测定上相、下相以及混合样品的表观黏度。在0.1 s-1～100 s-1的剪切速率范围内进行稳态剪切流变试验。受控应力范围:0.1 Pa～10 Pa，测量温度：25℃，平板直径:40 mm，间隙：0.5 mm。

1.3.6 样品外观观察

将不同质量比的HD-WPC/HM-P样品离心结束后观察相分离现象，拍照。

1.4 数据统计分析

每个试验重复3次，结果表示为平均数±SD。数据统计分析采用Statistix 8.1（分析软件，St Paul，MN）软件包中Linear Models程序进行，差异显著性（P<0.05）分析使用Tukey HSD程序。采用sigmaplot 12.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 相分离体系中上相组分分析

这组实验的目的是表征不同质量比（1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1） 的 HD-WPC 与 HM-P 形成的相分离体系（pH=7.0）中上、下相的相组成性质。不同质量比的混合溶液经过离心后出现明显的相分离行为。Laneuville等[17]研究发现样品在混合后立即形成浑浊的分散体，其在所研究的所有条件下不平衡并且相分离。发生相分离的速率主要取决于混合体系的黏度。因此，为了加速平衡相分离，将混合体系经过离心处理，得到含有顶层相和生物聚合物沉淀。蛋白/多糖相分离体系可以视为水包水（water in water，W/W）乳液。W/W乳液是一种分散体系，其中一种不混溶的水溶液的液滴分散在另一种生物聚合物水溶液中[18]。其特征在于生物聚合物在共存阶段的共溶性[19]。

图1所示的是不同质量比的HD-WPC/HM-P混合体系中上相蛋白、多糖浓度分析。

图1 不同质量比的HD-WPC/HM-P相分离体系中上相蛋白、多糖浓度Fig.1 Concentration of proteins and polysaccharides in upper phases of HD-WPC/HM-P phase separation system with different quality ratios

从图1中我们可以看出，不同质量比的相分离系统中上相都含有蛋白和多糖，且多糖含量总高于蛋白含量，证明上相为多糖（HM-P）富集相。从图1中还可以发现，上相多糖含量随着HD-WPC/HM-P混合质量比的增加而显著降低（P<0.05）。HD-WPC/HM-P质量比由1∶1增加到5∶1时，多糖含量从50.83 mg/mL降低到46.59 mg/mL，质量比为5∶1时达到最小值，这可能是由于随着混合比例增加，HM-P含量逐渐降低，使得HD-WPC与HM-P之间的排斥力降低。随着比例的增加，蛋白含量逐渐增加，但是低于多糖含量，说明上相中仍然含有大量的蛋白。Jara等[20]研究发现初始羟丙基甲基纤维素（Hydroxypropylmethylcellulose,HPMC）浓度降低，在恒定的WPC浓度下，会降低分离的驱动力，使上相中更多的蛋白质与HPMC共存。因此，初始浓度较低的HPMC可以在上相中含有更多的蛋白质。

2.2 相分离体系中下相组分分析

不同质量比的HD-WPC/HM-P相分离混合体系中下相蛋白、多糖浓度分析如图2所示。

图2 不同质量比的HD-WPC/HM-P相分离体系中下相蛋白、多糖浓度Fig.2 Concentration of proteins and polysaccharides in lower phases of HD-WPC/HM-P phase separation system with different quality ratios

从图2中我们可以看出，不同质量比的HDWPC/HM-P相分离混合体系的下相中，均含有蛋白和多糖，这与上相分析结果相同，然而下相蛋白含量高于多糖含量，蛋白含量随着混合质量比的增加显著增加（P<0.05），证明下相为蛋白（HD-WPC）富集相。HD-WPC/HM-P混合质量比为1∶1的相分离体系下相中，蛋白含量约为多糖含量的250%。随着混合质量比的增加，比例为5∶1时蛋白含量达到最大值，下相中含有多糖含量较低。这是由于随着混合质量比增加，果胶含量逐渐降低，比例为5∶1时，多糖参与复合物形成的量减少，蛋白质聚集体形成量增加。此外，蛋白质浓度较高使得蛋白相互接近而容易发生碰撞和聚集[17]。

通过分析不同HD-WPC与HM-P质量比形成的相分离体系（pH=7.0）中上、下相分析可知，上相为多糖富集相，下相为蛋白富集相，组成分析结果与其他研究结果一致，发生相分离的体系形成两个富集相，每一相中富含一种高分子物质[12，21]。蛋白/多糖混合体系相分离行为的发生是由于热力学不相容性，这种不相容性是由于耗竭-絮凝相互作用引起的[22]。当HD-WPC和HM-P两种不相容的生物大分子在系统中共同存在时，由于它们之间的不相容性形成耗竭层，这是由于HM-P粒子周围的HDWPC负吸附，使HM-P周围HD-WPC浓度较低。由于布朗运动，耗竭层包围的HM-P之间发生耗竭层重叠，导致HM-P粒子间与分散介质形成溶剂（HD-WPC）浓度梯度，渗透压力促使HD-WPC从HM-P粒子间扩散到分散介质中，使HM-P粒子克服彼此之间的静电斥力而聚集，由于分子之间的热力学不稳定性导致相分离的产生，具体过程如图3所示。

图3 耗竭-絮凝作用机理Fig.3 The mechanism of depletion-flocculation

HD-WPC，是一种两性聚电解质，Syrbe等[23]研究发现在溶液pH值为5～7时，一些中性多糖如葡聚糖与天然乳清蛋白之间发生相分离现象；而一些阴离子多糖如高甲氧基果胶会与变性乳清蛋白发生相分离。Kim等[21]报道未经处理的乳清分离蛋白未出现相分离的现象，这可能是由于没有盐离子条件下，乳清蛋白分子在pH7.0，温度高于热变性温度时，易形成长丝状结构。这些细丝是由球状蛋白质部分展开并暴露在表面上的非极性基团形成，然后作为蛋白质分子之间的疏水交联，一旦蛋白质分子聚合成这些相对较高分子量的结构，通常有利于整个系统中两种不同生物聚合物均匀分布的混合熵被大大降低，所以与天然乳清蛋白相比，热处理乳清蛋白更利于相分离的发生。

2.3 相分离混合体系的流变行为

在分子分级现象的影响下，高分子物质的性质在相分离前后通常会发生明显变化，因此利用流变方法测定混合样品以及相分离样品上、下相的表观黏度随剪切速率的变化趋势。图4所示的是不同HD-WPC/HM-P质量比的相分离混合体系的表观黏度随着剪切速率的变化。

图4 不同质量比的HD-WPC/HM-P相分离体系表观黏度分析Fig.4 Apparent viscosity analysis of HD-WPC/HM-P phase seperation system with different quality proportions

从图4中可以发现，HD-WPC/HM-P质量比不超过3∶1时，混合体系的表观黏度随着剪切速率的增加而逐渐降低，表现出明显的剪切变稀行为，为假塑性流体，且质量比为1∶1时表观黏度最大。说明随着剪切速率的增加可能破坏了热变性乳清蛋白和果胶形成的微弱的结构，颗粒可能变性和破碎，使颗粒之间的摩擦作用变小，从而降低了黏度值[24]。当 HD-WPC/HM-P 质量比为 4∶1、5∶1时，表观黏度并未受到剪切速率的较大影响，在0.1 s-1～100 s-1剪切速率范围内趋势比较平缓，接近于0，表现出近似牛顿流体的性质。这可能是因为HM-P的浓度过低，分子链较短，阴性多糖与阳性蛋白之间发生相互作用极弱，使体系表现出近似牛顿流体的性质。Bourriot等[18]研究黏度对相分离特性的影响时指出低黏度的多糖因占据较小的胶粒空间使得排阻效应降低，使得乳蛋白（尤其是酪蛋白）胶粒间的凝聚作用大大降低。

2.4 相分离混合体系中上相、下相流变行为

相分离的动力学取决于生物聚合物相的流变性质，因此我们还测定上、下相的表观黏度变化趋势。图 5（a）、（b）分别为上相、下相表观黏度随着剪切速率的变化趋势。

图5 不同质量比的HD-WPC/HM-P相分离体系中上相（a）、下相（b）表观黏度分析Fig.5 Apparent viscosity analysis of upper（a）and lower（b）phases in different quality ratios of HD-WPC/HM-P phase separation system

从图5（a）中可以看到，上相表观黏度在质量比不超过3∶1时，表观黏度随着剪切速率的增加而降低，特别剪切速率超过1 s-1时表现出明显的剪切稀释行为，为假塑性流体。当质量比为4∶1、5∶1时，表观黏度随剪切速率变化不大，趋势比较平缓，接近于0，表现出近似牛顿流体的性质，这与混合体系观察到的相似。图5（b）所示的是下相表观黏度的变化。我们可以观察到不同HD-WPC/HM-P质量比的混合体系的表观黏度随着剪切速率的增加均呈现降低的趋势，表现出剪切变稀行为。而且随着混合质量比的增加，表观黏度逐渐降低。从图5中还可以观察到，在0.1 s-1～100 s-1剪切速率范围内，下相的表观黏度远高于上相。可以假设，下相蛋白浓度高导致该相表观黏度高[12]。

相分离混合体系的表观黏度与上相表观黏度相似，但是略高于上相。胶态分散体的总粘度由连续相的黏度以及有效颗粒浓度决定[25-26]。McClements等[27]研究发现由于胶体分散体的黏度应始终大于连续相的黏度，因此可以知道构成系统连续相的是上相还是下相。由2.3分析可知上相表观黏度明显低于下相，表明富含多糖的上相在这个系统中形成连续相，而富含蛋白的下相为分散相。

2.5 相分离混合体系外观变化

图6所示的是不同质量比的HD-WPC/HM-P相分离混合体系离心2 h后外观的变化。

图6 不同质量比的HD-WPC/HM-P混合体系外观分析Fig.6 Appearance analysis of differen qualityt ratio HD-WPC/HM-P phase separation systems

从图6中可以发现，不同比例的混合体系均发生相分离现象。下相体积随着蛋白浓度的增加而增加，上相体积随着多糖浓度增加而增加，由此也可以推断出下相可能为蛋白富集相，上相为多糖富集相，这与前面研究上、下相蛋白多糖含量的结果一致。

3 结论

本试验主要探讨了不同质量比（1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1）的热变性乳清浓缩蛋白与高甲氧基果胶对整个混合体系相分离行为的影响，通过分析相分离混合体系中蛋白、多糖浓度、表观黏度以及外观可知，不同质量比的混合体系均发生相分离行为，上相为多糖富集相，下相为蛋白富集相。混合溶液的表观黏度随着剪切速率的增加而降低，且随着混合HD-WPC/HM-P质量比的增加，表观黏度逐渐降低。结果表明，不同比例的混合体系均发生相分离行为，且上相为连续相，下相为分散相，这为我们后续在水凝胶中的研究奠定一定的理论基础。

[1]Nunes M C,Batista P,Raymundo A,et al.Vegetable proteins and milk puddings[J].Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2003,31(1):21-29

[2]Fang Y,Li L,Inoue C,et al.Associative and segregative phase separations of gelatin/kappa-carrageenan aqueous mixtures[J].Langmuir,2006,22(23):9532-9537

[3]Antonov Y A,Moldenaers P.Structure formation and phase-separation behaviour of aqueous casein-alginate emulsions in the presence of strong polyelectrolyte[J].Food Hydrocolloids,2011,25(3):350-360

[4]Bergfeldt K,Lennart Piculell A,Linse P.Segregation and Association in Mixed Polymer Solutions from Flory Huggins Model Calculations[J].Journal of Physical Chemistry,1996,100(9):3680-3687

[5]Doublier J L,Garnier C,Renard D,et al.Protein-polysaccharide interactions[J].Current Opinion in Colloid&Interface Science,2000,5:202-214

[6]Kruif C G D,Weinbreck F,Vries R D.Complex coacervation of proteins and anionic polysaccharides[J].Current Opinion in Colloid&Interface Science,2005,9(5):340-349

[7]Grinberg V Y,Tolstoguzov V B.Thermodynamic incompatibility of proteins and polysaccharides in solutions[J].Food Hydrocolloids,1997,11(2):145-158

[8]Tuinier R,Rolin C,de Kruif C G.Electrosorption of pectin onto casein micelles[J].Biomacromolecules,2002,3(3):632-638

[9]韩雪,孙冰.乳清蛋白的功能特性及应用[J].中国乳品工业,2003,31(3):28-30

[10]张丹凤.乳清蛋白的特性及其在乳制品生产中的应用[J].中国乳业,2007(3):27-28

[11]Setiowatia A D,Vermeira L,Martinsb J,et al.Improved heat stability of protein solutions and O/W emulsions upon dry heat treatment of whey protein isolate in the presence of low-methoxyl pectin[J].Colloids and Surfaces A:Physicochemical and Engineering Aspects,2016,510:93-103

[12]Matalanis A,Lesmes U,Decker E A,et al.Fabrication and characterization of filled hydrogel particles based on sequential segregative and aggregative biopolymer phase separation[J].Food Hydrocolloids,2010,24(8):689-701

[13]Perrechil F A,Cunha R L.Development of multiple emulsions based on the repulsive interaction between sodium caseinate and LBG[J].Food Hydrocolloids,2012,26(1):126-134

[14]Bosnea L A,Moschakis T,Biliaderis C G.Complex Coacervation as a Novel Microencapsulation Technique to Improve Viability of Probiotics Under Different Stresses[J].Food&Bioprocess Technology,2014,7(10):2767-2781

[15]Bradford M M.A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of proteins utilizing the principle of protein dyebinding[J].Biochemistry,1976,72:248-258

[16]Dubois M,Gilles K A,Hamilton J K,et al.Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances[J].Analytical Chemistry,1956,28(3):350-356

[17]Laneuville S I,Paquin P,Turgeon S L.Effect of preparation conditions on the characteristics of whey protein-xanthan gum complexes.[J].Food Hydrocolloids,2000,14(4):305-314

[18]Bourriot S,Garnier C,Doublier J L.Phase separation,rheology and microstructure of micellar casein-guar gum mixtures[J].Food Hydrocolloids,1999,13(1):43-49

[19]Turgeon S L,Beaulieu M,Schmitt C,et al.Protein-polysaccharide interactions:phase-ordering kinetics,thermodynamic and structural aspects[J].Current Opinion in Colloid&Interface Science,2003,8(4):401-414

[20]Jara F,Pilosof AMR.Partitioning of α -lactalbumin and β -lactoglobulin in whey protein concentrate/hydroxypropylmethylcellulose aqueous two-phase systems[J].Food Hydrocolloids,2011,25(3):374-380

[21]Kim H J,Decker E A,Mcclements D J.Preparation of multiple emulsions based on thermodynamic incompatibility of heat-denatured whey protein and pectin solutions[J].Food Hydrocolloids,2006,20(5):586-595

[22]李向红,裘爱泳,华欲飞,等.蛋白质-多糖相分离性质及其研究进展[J].粮食与油脂,2006(9):14-15

[23]Syrbe A,Bauer W J,Klostermeyer H.Polymer science concepts in dairy systems--an overview of milk protein and food hydrocolloid interaction[J].International Dairy Journal,1998,8(3):179-193

[24]王翠娜.聚合乳清蛋白与多糖相互作用对其凝胶特性影响及应用[D].长春:吉林大学,2015.

[25]Genovese D B,Lozano J E,Rao M A.The rheology of colloidal and noncolloidal food dispersions[J].Journal of Food Science,2007,72(2):R11-R20

[26]Mcclements D J,Decker E A,Weiss J.Emulsion-Based Delivery Systems for Lipophilic Bioactive Components[J].Journal of Food Science,2007,72(8):109-24

[27]Mcclements D J.Food emulsions:principles,practices,and techniques[J].International Journal of Food Science&Technology,1999,36(2):223-224