核酸适配体筛选技术研究进展

许涛，彭智辉，王泽峰，周佳琪，邓乐

湖南师范大学 生命科学学院，省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室，湖南 长沙 410081

核酸适配体也叫适体、适配子，是利用指数富集的配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）从特定的寡核苷酸库中筛选出的对靶标有特异性相互作用的单链DNA（ssDNA）或RNA，具有高特异性、高亲和力、合成成本低、易快速制备、运输和储存成本低等优势[1-2]，近30年来已广泛应用于生物研究的各个领域。适配体可引入荧光基团[3]、连接纳米材料[4]等用于检测各种靶标。如本实验室通过将适配体与纳米材料如量子点、碳纳米管、氧化石墨烯等修饰构建生物传感器，应用于ATP[5]、流感病毒[6]、K88 大肠杆菌[7]、沙门菌[8-9]等的检测，有效降低了检测时间和成本。

然而，适配体在应用方面相比于抗体还远远不够，影响适配体发展的瓶颈主要是适配体的筛选机理还未完全清楚，且当前适配体的应用文献快速增长而筛选相关的文献开始滞停。笔者对2013以来（截至2017-10-08）的适配体相关文献进行了检索统计（表1），有关适配体的文献有6634篇，而其中与筛选有关的只有1063篇，2014、2015年到达高峰期，之后开始下降。核酸适配体筛选过程主要包括确立筛选方法、建立筛选文库、实施具体筛选策略、表征其亲和力。对其筛选过程进行优化，旨在改良和发展SELEX技术，提高筛选效率与适配体性能。

我们针对当前较为热门的核酸库优化、筛选策略改进、次级文库序列分析和适配体结构优化等筛选过程的近年相关文献数据进行统计（表1），并对其研究进展做简要综述。

1 核酸库优化

2013年至今近25%（241篇）的适配体筛选文献与核酸文库优化相关，由此可见，合理的核酸库优化方法对适配体筛选至关重要。核酸库优化应结合整个筛选流程，以增加核酸库的稳定性，提高对靶标的亲和力，避免核酸酶的降解以及提高筛选效率。从其中较为常见的非天然核苷酸替代传统核苷酸、镜像核酸库代替核酸库等优化方法相关文献发表量来看，近2年相对于2013、2014年有所下降，推测可能是因为新的筛选方法如微流控、微阵列等的出现，使人们对核酸库优化的关注度下降。尽管如此，作为筛选的基础，对核酸库优化方法进行探讨仍很有必要。

1.1 非天然核苷酸替代传统核苷酸

为提高核酸库的稳定性，增强其对靶标的亲和力，可以对核酸分子进行设计修饰，如氟代、氨基化、硫代磷酸化或甲基化等[10]。Lamberti等[11]在2′位氟化的随机RNA文库中，通过磁珠固定法筛选出Kd=4.15 nmol/L的癌抗原125的适配体，可开发作为诊断工具使用。Minagawa等[12]使用baseappended base（BAB）方法，用尿嘧啶代替胸腺嘧啶修饰DNA文库，经过8轮选择筛选出α唾液淀粉酶的高特异性适配体AMYm1。实验分析表明，与天然核酸库相比，BAB法修饰的核酸库可以获得更多不同的构象来适应不同的靶标，对未来适配体发展非常有参考价值。Tolle等[13]研究了一种新颖的通用型碱基修饰方法，通过核酸文库化学空间的模块化扩增，在复制扩增后拥有更多的化学修饰位点，适用于筛选各种不同的甚至是目前很难筛选到的适配体。用非天然核苷酸替代传统核苷酸对核酸库进行修饰方法颇多，容易实现，是常见的优化方式。

1.2 镜像核酸库代替核酸库

对核酸分子进行设计修饰可提高其稳定性，但不能消除核酸酶对核酸分子的降解。而镜像适配体序列作为天然DNA或RNA的对映体，具有适配体的特性但对核酸酶不敏感，因而常用于体内小分子（如肽类激素、细胞因子）适配体的筛选。Wang等[14]化学合成了D-氨基酸聚合酶，能识别和催化L-DNA模板转录聚合，可用于催化生成新的镜像核酸库或镜像适配体。Szeitner等[15]以肌钙蛋白Ⅰ中多肽的对映体为靶标，用镜像核酸库筛选获得Kd为3.5和10.7 nmol/L的镜像适配体。Vater等[16]对筛选出的3种镜像适配体的研究表明其十分安全，可用于治疗各种不同疾病。

表1 Web of Science适配体筛选相关文献发表量（2013-01-01～2017-10-08）

2 适配体的筛选策略

适配体筛选策略在筛选技术中最为重要，目前传统的筛选策略已较为成熟，2011年以来，本实验室先后用多孔板吸附、离心分离、免疫磁珠法等筛选策略筛选出大肠杆菌K88菌毛蛋白[17]、细胞[7]适配体，鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白[18]、细胞[19]适配体等。近几年，一些新的筛选策略如毛细管电泳筛选、微流控芯片技术、粒子展示、微阵列芯片等技术被用于筛选适配体，而且多种方法开始交叉使用，以达到以更少的轮次筛选出更优适配体的目的，且亲和力越来越高。

2.1 毛细管电泳-SELEX技术

毛细管电泳（CE）由于其超高的分离效率广泛应用于生物分析、食品安全分析以及医学检测等领域。2004年首次引入SELEX技术，即CESELEX技术，发现只需要1～4轮筛选（传统方法则需要8～12轮）就可获得核酸适配体[20]。但CESELEX技术进样体积为纳摩尔级别，文库中DNA分子的数量通常少于1013，因此对筛选技术要求更高[21]。

Ruff等[22]结合定量PCR方法对CE-SELEX技术做了改进，3轮即筛选到牛血清蛋白的适配体。Eaton等[23]利用CE-SELEX技术筛选到卵巢癌标志物的核酸适配体，结合高通量测序与生物信息学在线数据库对适配体进行对比分析，为适配体的大量、快速筛选提供了新思路。罗昭锋等[24]用毛细管电泳技术分离，分段收集复合物后分别进行荧光定量PCR扩增，建立了一种快速的适配体筛选方法。

结合表1数据可以看出，CE-SELEX技术兴起相对较早，在新兴筛选策略中的应用仍远远大于其他几种，仪器操作简单、使用成本较低、高效快速的筛选优势使其仍旧十分热门。

2.2 微流控芯片-SELEX技术

微流控芯片是以硅制品（如玻璃）和有机聚合物为材料，用微细加工技术在芯片上构建由微通道、微反应室、储液池等微功能单元构成的微流路系统[25]。将微流控芯片用于SELEX技术，可使样品与试剂的消耗降低至纳升甚至皮升级，分析速度成十倍上百倍地提高而费用大大降低。

Lou等[26]设计了一个连续微流磁激活分离芯片，用缓冲液连续层流冲洗带靶标的磁珠，只需1轮便可筛选出特异性核酸适配体，相比于传统SELEX技术，可降低筛选轮次，获得更高亲和力的适配体。Hung等[27]用微流控芯片-SELEX技术，建立了一种高通量、快速、高效的细胞适配体筛选技术。Olsen等[28]提出了一种简单的微流控方法，结合磁珠的生化反应和溶液中寡核苷酸的电化学转移，实现了在一个芯片上完成整个SELEX过程的筛选和富集，并将筛选时间减少至4 h。Hong等[29]利用磁珠图案化芯片建立了一个多功能的适配体筛选平台，使得筛选过程变得更为高效和可控。

将微流控芯片技术应用于适配体筛选是较为新颖的筛选方法，它克服了人为操作导致的不利因素，能极大地提高筛选速度。然而，芯片建模成本较高，目前应用仍旧较少。如果能够找到通用的微流控芯片并进行产业化生产，必定能使微流控芯片技术成为未来的发展趋势。

2.3 微阵列芯片-SELEX技术

传统的适配体筛选方法需要对每个适配体的亲和力与特异性进行分析，费时费力，因而需要一种多路复合的方法同时对成千上万的适配体进行检测。微阵列芯片是将数十到数万个探针分子以阵列的形式固定于一张厘米见方的基板上，俘获样品中的靶分子，通过荧光、化学发光或质谱分析系统读取每个位点的信息，具有高通、微量和自动化等优点[30]。

微阵列芯片技术在药物筛选和分离检测方面应用较多，近几年才用于适配体筛选。Gotrik等[31]用DNA微阵列芯片同时识别出上千条候选适配体，通过结合微流控技术、HTS鉴定亲和力和特异性，分离出高效适配体，从而改变传统筛选需要的轮次多、鉴定方法耗时等缺点。Liu等[32]将微阵列芯片技术与微流控芯片技术结合起来，通过荧光微阵列扫描观察候选适配体与靶标之间的相互作用，3轮便筛选到乳铁蛋白的5个稳定高效适配体。

由于微阵列芯片技术所需设备昂贵、多样品平行分析能力不够、分析时间长，而微流控芯片技术高效快速，目前常将微阵列芯片技术与微流控芯片技术联合使用。

2.4 粒子展示-SELEX技术

粒子展示法多用于同源蛋白质的多重靶分子交替筛选，SELEX过程中须结合微乳液PCR技术及流式细胞仪[33]。粒子展示法中每个适配体的相对亲和力是独立测量和分类的，在筛选中能实现更高水平的浓缩，可追踪到每一轮单个适配体的结合情况，随时调整分选策略，大大减少筛选轮数（只需3～4轮），从而减小多轮筛选扩增中不可避免的选择偏向，因而筛选效率比传统的SELEX技术更高。

目前已利用此方法筛选到凝血酶[34]、纤溶酶原激活物1[35]、酪氨酸蛋白磷酸化酶[36]及肿瘤坏死因子超家族成员4-1BB[37]的高亲和力适配体。Wang等[38]研究出一种多参数粒子展示法，每小时可分选107个核酸，且在浓度低至纳摩尔的人血清中筛选出3种不同蛋白的适配体。受流式细胞仪分选能力的局限，如果可在微乳液中进行体外转录，则可实现RNA适配体的筛选[39]。

作为一个新兴的筛选技术，粒子展示法有独特的筛选优势，发展潜力巨大。但实际操作中要使用到微乳液PCR和流式细胞仪分选，流程较为复杂，要求的操作技术高，适用范围较窄，因此在新兴策略中并没有被大规模应用。

3 次级文库序列分析

筛选出的候选适配体文库需要通过克隆测序得到DNA序列。常规的适配体筛选工作重复性高，费时费力，需要在10多轮常规筛选后才能进行测序，得到几条亲和力和特异性较高的适配体。由于筛选轮次过多，最后筛选出的适配体不一定是最优的。随着分子生物学与计算机技术的迅猛发展，高通量测序应运而生。通过对逐轮筛选出的次级库进行高通量测序，获得每轮次级库的序列信息，再用生物信息学方法分析出次级库中更有可能成为适配体序列的重复序列[40]。通过高通量测序可以降低筛选轮次，高效快速地筛选出更优适配体，减少人力物力损耗。

Rachel等[41]以卵巢癌生物标记物HE4为靶标，对每轮筛选获得的次级库进行高通量测序，发现重复序列的比值上升，证明每轮SELEX过程都有适配体序列的富集。Ditzler[42]用高通量筛选法评估了结合人类免疫缺陷病毒（HIV）反转录酶的RNA适配体，进一步验证了高通量测序技术的高效性。

从近年的文献数分析，虽然高通量测序技术应用于适配体筛选越来越多，但由于高通量测序的成本较高，在筛选应用中所占比例还很低。随着第三代测序技术和测序仪的迅猛发展，高通量测序成本将会逐步降低，毫无疑问它在适配体筛选方面的应用将会得到极大普及。

4 适配体结构优化

通过SELEX技术获得的适配体不一定可直接应用于检测，因而需要优化来改善和调节它们的功能[43]。对筛选得到的适配体，依据适配体与靶标的作用机理及后期检测和药物设计等目的考虑，可将适配体进行适当的结构优化，以提高亲和力和特异性、降低合成成本、延长其体内消除时间或抑制其降解。常用的优化方法有截短、化学修饰、锁核酸替换、突变、3′或 5′加帽等[44-45]。以下着重介绍应用最多的碱基突变与修饰和序列截短。

4.1 碱基突变与修饰

通过对适配体进行碱基突变或修饰，可提高其稳定性并增加其生物学活性，也为适配体与靶标分子结合提供更多的位点[46]。

Zheng等[47]设计了多条突变序列，将核苷酸突变为G-四联体结构所必需的鸟嘌呤核苷酸，使亲和力提高了30倍。张光普[48]等探索了一种引入烷基功能基团方法，设计合成烷基化修饰的核酸适配体，结果表明1位磷硫（PS）烷基化修饰可提高其与靶蛋白作用能力和血清稳定性，并表现出较强的肿瘤细胞生长抑制作用。

尽管出现相对较早，由于其独特的优势，碱基突变与修饰仍是目前甚至今后很长一段时间较为热门的结构优化方法。

4.2 序列截短

固定序列为适配体两端用于PCR扩增的引物区，约占全长的50%。Ellington等[49]发现，固定序列既不利于也不限制适配体的结合，只是最低限度地参与适配体的整体结构形成。减小分子量可以增加适配体的组织渗透率，因而可以选择一个家族中同源性较好的部分序列作为研究对象进行适当的剪裁，直至找到最短结合序列。

Huang等[50]截短乳腺癌异质性核糖核蛋白适配体的核心序列，经异核苷联合2′-脱氧肌苷修饰，其血清稳定性和靶标特异性明显提高。Zheng等[51]截去海洋聚醚类毒素适配体序列的引物区及非必需核苷酸，获得了2段与靶标有高亲和力的核心序列。Xu等[52]用结构计算建模方法截短前列腺特异膜抗原适配体，截短后的适配体拥有更短的核苷酸长度，所以更容易在体外合成，生产成本更低，其靶向治疗潜力更大。

序列截短增加了适配体与靶标的亲和力，减少了碱基数，有效提高了适配体的应用价值，因而虽然关于适配体筛选的文献开始减少，序列截短应用的研究却有所上升。

5 结语

适配体性质独特，前景很广，但如今可用的适配体数量远不能满足科研需求，其筛选方法仍须完善，其与靶标的作用机理亟待阐明。本文从其筛选过程出发，总结了较为新颖热门的适配体筛选方法，以便于相关研究者更快地了解适配体发展动向。

从目前适配体在诊断和治疗方面的应用效果来看，制约适配体进一步应用的影响因素主要有：①适配体亲和力不高或重现性不好；②适配体筛选周期长，与靶标亲和结合的机理研究不深入；③适配体筛选过程监控手段不多，特别是低成本高效简便的方法不多。这些因素都和适配体筛选技术有关，尽管近年来新的筛选策略开始出现，但更多的目光还是放在适配体的应用而不是筛选方向上，这也直接导致了2015年以来关于适配体筛选方法的文献数量减少，关于筛选方法的研究开始降温，其筛选技术的发展任重道远。

随着适配体研究的深入，微阵列、微流控芯片、纳米技术、高通量测序等高科技手段与之结合，适配体的应用将更加广泛。从目前的研究情况来看，我们认为今后应从以下方面完善适配体筛选技术：①将高通量测序和一些先进的筛选策略相结合，以最少的筛选轮数和最小的扩增偏差筛选得到高特异性高亲和力的适配体，在应用时提高重现性；②探究适配体与靶标之间相互作用的具体机制，找到更高效的适配体筛选方法；③发展适配体筛选过程监控技术，结合单分子测序等新一代测序方法，建立更加精准、自动化的筛选平台，降低筛选轮次；④将适配体与抗体类比，利用其独特的可变复性、可碱基配对、可复制等性质，应用于影像、检测、诊断、传感器、药物靶向运输、亲和捕获纯化等方面。相信从以上几个方面优化适配体筛选过程，筛选出更多可用适配体，极有可能超过抗体，广泛应用于生物分析、食品安全、临床医学诊断治疗及其他领域。

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