利用酵母双杂交技术筛选人PROKR2蛋白C端相互作用蛋白

周晓涛，周文涛，夏开德，刘化蝶，彭震，赵云娟，迪丽娜尔·波拉提，李家大

1.新疆医科大学 基础医学院免疫学教研室，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学 第五附属医院，新疆 乌鲁木齐 830011；3.贵州省妇幼保健医院，贵州 贵阳 550000；4.中南大学 医学遗传学国家重点实验室，湖南 长沙 410000

人前动力蛋白受体2（human prokineticin re⁃ceptor 2，hPROKR2）由384个氨基酸残基构成，其基因位于人类第20号染色体（20p12.3），mRNA全长2242 bp。hPROKR2属于G蛋白偶联受体，当其与配体前动力蛋白（prokineticin，PK）结合后，可参与血管发生、平滑肌收缩及促胚胎期神经元发育和迁移[1-3]。基因型研究发现hPROKR2和PK2的突变与Kallmann综合征和/或特发性（单纯性）促性腺激素型性腺功能减退的发病有关，主要表现为青春期延迟和不孕[4-6]。对hPROKR2分子功能的研究已有很多，但多集中在其胞内区Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ环功能方面[7-9]，而针对其胞内区C端的功能研究仍是空白[10]。我们欲以酵母双杂交技术作为实验平台，将hPROKR2胞内区C端（333～384 aa）由52个氨基酸残基组成的蛋白作为诱饵（图1），在人cDNA文库中寻找能与hPROKR2 C端相互作用的蛋白，以丰富G蛋白偶联受体（G proteincoupled receptor，GPCR）相互作用蛋白（GPCR in⁃teracting proteins，GIPs）的信息，并进一步研究hPROKR2的功能。

1 材料与方法

1.1 材料

酿酒酵母Y2HGold（MATa表型），冻存菌种Y2HGold-hPROKR2-Ct（Ct，C 端），人 cDNA 文库，酵母培养基和营养缺陷型培养基SDO（SD/-Trp，SD/-Leu）、DDO（SD/-Leu/-Trp）、QDO（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp），金 担 子 素 A（aureobasidin A，AbA），X-α-Gal购自Clontech公司；感受态大肠杆菌DH5α、质粒pcDNA3.1-HA-SNAPIN、pGEX-3X-hPROKR2 Ct为中南大学医学遗传学国家重点实验室保存；E.Z.NA plasmid Mini试剂盒购自Ome⁃ga公司；溶壁酶、二甲亚砜（DMSO）等试剂购自Sigma公司。

图1 hPROKR2蛋白C端模式图

1.2 酵母双杂交及文库筛选

1.2.1 杂交 用无菌枪头挑取冻存菌种Y2HGoldhPROKR2-Ct在SD/-Trp琼脂板上划线，30℃培养至单克隆长出后，挑取1个单克隆（直径2 mm）置于50 mL SD/-Trp液体培养基（含50 μg/mL卡那霉素）中，于30℃、250 r/min振荡培养30～40 h，至D600nm值为0.8时收集菌液，1000 r/min离心5 min，弃上清，再加入4 mL SD/-Trp液体培养基混悬。取文库1 mL、SD/-Trp菌液1 mL、2×YPDA液体培养基45 mL加入2 L无菌锥形瓶中，于30℃、50 r/min培养24 h，期间取10 μL培养物用生理盐水稀释至1/10，用相差倒置显微镜观察，当出现三聚体形态时，将菌液1000 r/min离心10 min，弃上清，加入0.5×YPDA液体培养基（含50 μg/mL卡那霉素）10 mL混悬，测量总体积，取其中10 μL杂交液做融合效率测定，其余以200 μL涂布于QDO板（直径150 mm）上，30℃培养3～5 d。

1.2.2 融合效率测定 将10 μL杂交混悬液用0.9%NaCl溶液分别稀释至 1/1000、1/10 000，各取 100 μL涂布于SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Leu/-Trp平板（直径100 mm），30℃培养3～5 d。融合效率计算公式：克隆融合效率=DDO皿上长出的克隆数×重悬杂交液量（mL）×10×稀释度。

1.3 相互作用阳性克隆的筛选及测序

用无菌枪头挑1个上述QDO平板上的克隆，在QDO/A/X平板上划线，30℃培养3～5 d，此时可以看到平板上出现蓝、白克隆分离现象；挑取其中的蓝色克隆，继续在QDO/A/X平板上划线，直至所有克隆均为蓝色；用无菌枪头挑取1个蓝色克隆置于2 mL QDO液体培养基中，30℃、250 r/min培养约48 h，取 500 μL菌液于-80℃冻存保种，余1.5 mL菌液以14 000 r/min、4℃离心5 min后弃上清，加入1×TE缓冲液100 μL、溶壁酶（15 U）20 μL混匀，37℃、280 r/min孵育 1 h，再加入20%SDS 200 μL，室温放置 10 min后高速离心10 min，弃上清；用E.Z.NA plasmid Mini试剂盒提取质粒，最终溶解在30 μL TE溶液中；取15 μL质粒转化感受态大肠杆菌DH10B，用含氨苄西林的LB平板筛选；取1个克隆，扩增后测序（pGADT7.A，T7引物正向测序）；根据文库所用质粒pGADT7-RecAB的序列及筛选到的质粒的测序结果，通过NCBI进行Blast比对，确定筛选出的蛋白序列，分析判断选取有意义的蛋白进行后续确证。

1.4 筛选到人cDNA文库质粒的自活性验证

1.4.1 制备酵母菌种Y2HGold感受态 无菌挑取冻存的酵母菌种Y2HGold在YPDA板上划线，30℃倒置培养3～5 d；挑1个单克隆（直径约2 mm）至3 mL 1×YPDA液体培养基中，30℃、250 r/min培养 12 h；取 1 μL 产物加入 5 mL 1×YPDA液体培养基中，于30℃、250 r/min培养过夜；离心（700 r/min，5 min）弃上清后加入20 mL 1×YPDA液体培养基重悬菌液，30℃、250 r/min培养3～5 h，至D600nm为0.4～0.5；离心（700 r/min，5 min）弃上清后加入6 mL无菌ddH2O重悬，离心弃上清后再加入300 μL 1.1×TE/LiAc重悬沉淀；瞬时高速离心后弃上清，加入 120 μL 1.1×TE/LiAc重悬菌液，置冰上待用。

1.4.2 将PGBKT7-hPROKR2-Ct质粒与筛选到的人cDNA文库质粒共转入酵母感受态 在2个预冷的EP管中同时加入50 μL感受态细胞、50 μg Yeastmaker Carrier DNA及100 ng筛选出的人cDNA文库质粒，再将100ngPGBKT7-hPROKR2-C端质粒或100 ng PGBKT7空质粒分别加入体系，加入500 μL PEG/LiAc温和混匀，30℃孵育30 min，加入20 μL DMSO混匀，42℃水浴15 min，高速离心后弃上清，加入500 μL YPD plus培养基重悬，30℃、250 r/min孵育60 min，高速离心弃上清后加入500 μL 0.9%NaCl溶液重悬，取100 μL涂布于DDO平板（直径100 mm）上，30℃倒置培养3～5 d，无菌挑取1个白色克隆分别在DDO/X、QDO/A/X平皿上划线，结果判定如表1。

1.5 GST pull down验证hPROKR2蛋白C端与SNAPIN的相互作用

将质粒pGEX-3X-hPROKR2 Ct（实验室储备）及pGEX-3X通过热激钙转法转入感受态大肠杆菌DH5α，IPTG诱导分别表达GST-hPROKR2 C端融合蛋白及GST蛋白，并经Western印迹鉴定。在鉴定无误的菌泥中加入PBS裂解缓冲液（含蛋白酶裂解液），超声波破碎后离心收集上清至新EP管，为细菌裂解液。每份细菌裂解液中均加入30 μL GST磁珠，4℃翻转 3 h后用 1 mL冰 PBS洗涤 4次（800 r/min离心 1 min），将 pcDNA3.1-HA-SNAPIN转染293T细胞，用1 mL GST pull down缓冲液（含蛋白酶裂解液）裂解并转至EP管中，4℃翻转90 min，离心后取上清至新EP管待用，此为细胞裂解液。取15 μL细胞裂解液作为Input。

在一份GST蛋白结合的GST磁珠中加入300 μL细胞裂解液，用GST pull down缓冲液（含蛋白酶裂解液）补足至1 mL，4℃翻转过夜，离心弃上清，用1 mL冰GST pull down缓冲液洗涤6次（800 r/min离心1 min），高速瞬时离心，尽可能吸尽上清，加入 30 μL 2×SDS上样缓冲液，95℃变性10 min，Western印迹检测HA-SNAPIN的存在。

2 结果

2.1 酵母双杂交及文库的筛选

2株酵母菌株的杂交液以30℃、50 r/min低速振荡培养24 h后，在相差倒置显微镜（×40）下可以看到“三叶草”样酵母占视野95%以上，说明杂交成功。本次实验共收获杂交液12.5 mL，每次取200 μL杂交液涂QDO板，共涂59块。图2中DDO板上显示100 μL稀释至1/10 000的杂交液经培养后长出110个克隆克隆，据此计算杂交融合效率为 110×12.5×10×10 000=1.375×108。

表1 酵母双杂交中真阳性与假阳性的判定

2.2 相互作用阳性克隆的筛选

12.5 mL杂交液共涂布于60块QDO培养皿上，30℃培养72 h后可见独立酵母克隆出现（图3A），用无菌枪头挑克隆在新的QDO/X板上划线，会出现蓝、白克隆分离现象（图3B），每次挑蓝色克隆再在新的QDO/X上划线，直至不再出现白色克隆为止（图3C）。挑取最后分离出来的蓝色克隆进行菌种冻存，并提取酵母质粒送华大公司测序。本次实验共挑选150个克隆测序，根据文库所用质粒pGADT7-RecAB的序列及测序结果与NCBI比对，共筛选到8个有意义的蛋白序列，进一步通过文献搜索对蛋白功能进行查询，综合考虑后认为其中6个蛋白具有研究意义，其中一个为人SNAPIN（NP_036569.1）的44～136位氨基酸序列。

2.3 筛选到人cDNA文库质粒的自活性验证

从图4A中DDO/X平板可看出，当人cDNA文库中的3、23号克隆与pGBKT7-hPROKR2-Ct共转入酵母菌Y2HGold时可使底物X-α-gal发生颜色改变，而两者与pGBKT7共转入酵母菌Y2HGold时不能使底物X-α-gal发生颜色的改变；1号克隆与pGBKT7-hPROKR2-C端或pGBKT7共转入酵母菌Y2HGold时，两者都可使底物X-α-gal发生颜色改变。从图4B中QDO/A/X平板可看出，3、23号克隆与pGBKT7-hPROKR2-Ct共转入酵母菌Y2HGold时可使底物X-α-gal发生颜色改变，抵抗金担子素A毒性长出蓝色克隆，而当两者与pGBKT7质粒共转入酵母菌Y2HGold时无克隆长出；1号克隆与pGBKT7-hPROKR2-C端或pGBKT7共转入酵母菌Y2HGold时都使底物X-α-gal发生颜色改变，且抵抗金担子素A毒性长出蓝色克隆。以上说明3、23号克隆为可能的相互作用蛋白，1号克隆为假阳性。

图2 杂交融合效率测定

图3 杂交液涂板与划线

2.4 GST pulll down实验验证hPROKR2蛋白C端与SNAPIN的相互作用

从图5可看出，原核表达的hPROKR2蛋白C端可与SNAPIN相互作用。

图4 筛选出克隆的自活性验证

图5 GST pull down实验检测hPROKR2蛋白与SNAPIN之间的相互作用

3 讨论

GIPs可以与GPCR的细胞内环、跨膜区及C端结合，有着很多重要的功能，如将GPCR靶向运输到特异的亚细胞器、参与GPCR与下游效应分子的相互作用、协助GPCR变构从而发挥受体功能等。hPROKR2是GPCR家族中的一员，其结构包括7个跨膜螺旋（TM）、3个细胞内环（IL1～3）及胞内C端。hPROKR2与相应配体PK结合后可激活Gq/11，导致胞浆内磷酸肌醇增加，产生钙流[11]；也可通过激活Gi/o降低胞内cAMP的浓度[12]，激活Go通过使丝裂原活化蛋白激酶磷酸化从而传递信号[11]，参与人体的各种生理过程，包括血管生成、胃肠道蠕动、昼夜节律、情绪和痛觉[1,2,13-15]。目前研究多集中在hPROKR2的结构与功能方面，在其相互作用蛋白及信号通路激活等方面的研究较少。GPCR的胞内区C端在GPCR的细胞生物学功能中具有重大意义，因此寻找与hPROKR2胞内区C端相互作用的GIPs，对于进一步理解hPROKR2的功能尤为重要。

酵母双杂交系统被广泛用于研究已知蛋白间的相互作用、寻找2个互作蛋白间起关键作用的结构域、寻找靶蛋白的互作新蛋白等方面。酵母转录激活因子GAL4的N端有一个由147个氨基酸残基组成的DNA结合域（DNA binding do⁃main，BD），C端有一个由113个氨基酸残基组成的转录激活域（transcription activation domain，AD）。BD和AD在功能上是相互独立的，其中BD可与上游的激活序列（upstream activating se⁃quence，UAS）结合，AD可激活UAS下游的基因进行转录，但仅当两者在一起时GAL4才具有完整的转录激活因子功能。酵母双杂交技术就是建立在这个原理之上的：当作为诱饵的已知蛋白——BD融合蛋白、文库中随机序列——AD融合蛋白在酵母内正常表达，并且两者能相互结合时，GAL4分子的BD与AD结合在一起，具有完整的转录激活因子功能，从而激活UAS下游基因进行转录。在选择性培养基上，符合条件的克隆就能抵抗氨基酸营养缺失生长出来，并发生相应的颜色改变。在本实验中，我们用hPROKR2蛋白C端（333～384 aa）作为诱饵，在人 cDNA 文库随机表达片段中寻找其互作蛋白。杂交步骤完成后，我们尽可能将所有的杂交液涂板。按照随机组合的原则，72 h后DDO平皿上长出来的酵母克隆中有可能含有hPROKR2蛋白C端和多个来自人cDNA文库的随机片段，当然其中有一个为互作文库片段，在DDO平皿上划线时就会出现“克隆分离”现象，具体表现为划线过程中会出现蓝、白克隆分离。因此，实验中需要在DDO平皿上反复划线，直到出现的克隆全部为蓝色，说明在此蓝色克隆里仅存在与hPROKR2蛋白C端及与其相互作用的人cDNA文库片段蛋白。由于酵母为真核生物，有自己的基因组序列，故一般存在于酵母中的质粒很少，从酵母中提取质粒后，须进一步转化细菌感受态进行扩增并测序。特别须提出的是，在酵母双杂交中，诱饵基因是构建在质粒pGBKT7（卡那霉素抗性）上的，而人cDNA文库片段是在pGADT7-RecAB质粒（氨苄西林抗性）上的，从酵母中提取质粒后采用含氨苄西林的培养基进行选择培养时，则仅有与hPROKR2蛋白C端互作的人cDNA片段才会被扩增出来。

在酵母双杂交实验中，还有一些问题需要注意：①为了保证杂交实验的质量，一般要对杂交效率进行验证，本实验中杂交融合效率为1.375×108；②选择合适的杂交时间：在倒置显微镜下看到“三叶草”结构占80%～90%视野时，往往提示杂交较为成功；③杂交液的涂板：为了提高文库的使用效率，尽可能将所有杂交液全部涂于平板，且要尽可能涂布均匀，否则酵母的生长会受到阻碍，不易出现克隆。本实验中，我们在人cDNA文库中共筛选出331个克隆，经过后期反复划线验证，最终150个克隆被送测序，将测序结果上传NCBI进行序列比对，发现有意义蛋白的cDNA区有8个，多集中在前80个克隆中，其中有些序列反复多次出现，而这些序列就显得更为重要。通过NCBI在线Blast分析结果，再结合Unipro（http://www.uniprot.org/）在线蛋白质功能分析及对hPROKR2功能的考虑，认为有意义的克隆序列为5个，其中一个为SNAPIN。

鉴于酵母双杂交结果的假阳性较多，对从cDNA文库筛选得到的结果，一般还需用多种方法进一步验证。GST pull down实验常被用于体外验证2个蛋白间是否存在相互作用。我们首先在细菌中表达GST-hPROKR2蛋白C端，提取后将其挂在GST珠子上，再与真核细胞内表达的HASNAPIN蛋白体外结合，通过Werstern印迹检测HA-SNAPIN蛋白的有无，以判断两者之间是否存在互作关系。我们的实验结果显示hPROKR2蛋白C端与SNAPIN之间存在相互作用。综上，SNAPIN为hPROKR2蛋白C端相互作用蛋白，其对hPROKR2的功能调控还有待进一步研究。

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