超声波辅助提取天麻总酚工艺的研究

田孟华，杨新周，张国美，周瑞，丁培超，马勋静

（1.昭通市天麻研究院，云南昭通657000；2.德宏师范高等专科学校民族医药研究所，云南德宏678400；3.昭通市天麻特产局，云南昭通657000）

天麻（Gastrodia elata Blume）为兰科天麻属真菌异养型多年生草本植物，其干燥块茎入药。是我国常用名贵的中药材和出口创汇的主要药材品种之一，主产于四川、云南、贵州、陕西等省[1]。临床多用于头痛眩晕、肢体麻木、小儿惊风、癫痫、抽搐、破伤风等症，现代药理研究表明，天麻还具有增智健脑、清除自由基、延缓衰老的作用，并对老年性痴呆具有一定疗效。文献研究表明[2-5]，天麻中主要含有酚及其苷类，如天麻素、对羟基苯甲醛、对羟基苯甲醇、巴利森苷等；有机酸类，如琥珀酸、棕桐酸、柠檬酸等；甾醇类，如β-谷甾醇、胡萝卜苷；含氮类，如氨基酸、天麻多肽、天麻羟胺；多糖类等多种化合物。《中国药典》2015年版中天麻质量标准的制定也主要以天麻素和对羟基苯甲醇含量作为重要的参考指标。

随着化学成分和药理研究的深入，更多的报道显示，天麻的酚类成分是天麻主要活性物质。对天麻的镇静、催眠、抗惊厥、扩张平滑肌、抗血小板聚集的药理作用强度与天麻素含量比较发现，两者并未呈现正相关[6]。此外，张维明等从昭通天麻中提取的5个酯溶性酚性成分，并且明确了天麻的血管平滑肌松弛作用是这5个成分共同作用的结果[7]。云南大学的陶云海指出天麻的药理作用不能等同于天麻素，其他酚性成分对于其药效的发挥也是不可或缺的[8]。另外，以天麻素、对羟基苯甲醇及其衍生物与柠檬酸在不同羧基位点酯合形成的巴利森苷类化合物，是天麻中占比最大的一类物质之一，目前已经鉴定的巴利森苷类化合物就有33个[9-10]。现代药理研究表明，在改善空间学习记忆能力、抗精神病效应和抗细胞衰老作用方面，parishin和parishin C都要强于天麻素[11]。因此用天麻中酚类成分指标来衡量天麻的质量可能更为合理，也可能是鉴别天麻道地性的重要依据。

本试验通过福林酚（Folin-Ciocaieu）比色法测定天麻总酚，采用超声醇提法对影响天麻中总酚提取的因素进行了单因素试验和正交试验，旨在为天麻中总酚提取条件的优化提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

没食子酸（纯度98.5%）、福林酚试剂（生化试剂）、无水Na2CO3（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；超纯水。

UV-1750型紫外可见分光光度计：日本岛津公司；CP1502C、CP124C电子分析天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司）；HWS24型电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；SK250LHC型（35/53 kHz超声清洗器：上海科导超声仪器有限公司；FST-PE-UP型普利菲尔超纯水机：上海富诗特仪器设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 天麻粉样品制备

天麻采于云南省昭通市彝良县小草坝乡乌葩岭天麻科技示范园，经昭通市天麻研究院田孟华鉴定为天麻。鲜天麻清洗、蒸制、烘干，取天麻干燥块茎，粉碎，过筛，备用。

1.2.2 超声波提取总酚工艺

精密称取2 g天麻粉（精确到0.000 1 g），置于具塞三角瓶中，精密加入一定量的乙醇溶液，称重，浸泡24 h，超声提取（35 kHz，250 W），冷却至室温，再称重，用乙醇溶液补足减失的重量，滤过，取上清液，得待测液，备用。

1.2.3 没食子酸标准曲线的制作

精密称取没食子酸标准品25 mg，用水溶解并定容至250 mL，摇匀，制成0.1 mg/mL的没食子酸标准储备液。分别移取没食子酸标准储备液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0 mL于25 mL容量瓶中，分别加水5.0 mL，混匀，加福林酚试剂1.5 mL，混匀，室温放置6 min，加20%碳酸钠溶液1.5 mL，用水稀释至25 mL，定容，30℃水浴加热30 min，取出，摇匀，在765 nm处测定吸光度值（A），以A为横坐标，质量浓度（C）为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.4 总酚测定

Folin-Ciocaieu比色法[12-13]。取0.5 mL待测液于25 mL容量瓶中，加入5.0 mL水，混匀，加入1.5 mL福林酚试剂，混匀，室温放置6 min，加20%碳酸钠溶液1.5 mL，用水稀释至25 mL，定容，30℃水浴加热30 min，取出，摇匀，冷却至室温，待测。采用Folin-Ciocaileu比色法，于765 nm处测定吸光度值，计算样品中的天麻总酚含量。

1.2.5 单因素试验条件选择

1.2.5.1 粒径大小对天麻总酚含量的影响

分别精密称取粒径为 20、40、60、80、100 目的干燥天麻粉2 g（精确到0.000 1 g）于具塞三角瓶中，按液料比15∶1（mL/g）加入体积分数为70%乙醇水溶液，称重，浸泡 24 h，超声提取 30 min（35 kHz，250 W），冷却至室温，再称重，用乙醇溶液补足减失的重量，滤过，取上清液，测定总酚含量。

1.2.5.2 液料比对天麻总酚含量的影响

精密称取60目的干燥天麻粉2g（精确到0.0001g），按液料比 15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35 ∶1（mL/g），加入体积分数为70%的乙醇溶液，称重，浸泡24 h，超声提取30 min（35 kHz，250 W），冷却至室温，再称重，用乙醇溶液补足减失的重量，滤过，取上清液，测定总酚含量。

1.2.5.3 乙醇体积分数对天麻总酚含量的影响

精密称取60目的干燥天麻粉2g（精确到0.0001g），按照液料比 30∶1（mL/g）分别加入 40%、50%、60%、70%和80%的乙醇溶液，称重，浸泡24 h，超声提取30 min（35 kHz，250 W），冷却至室温，再称重，用乙醇溶液补足减失的重量，滤过，取上清液，测定总酚含量。

1.2.5.4 提取时间对天麻总酚含量的影响

精密称取60目的干燥天麻粉2g（精确到0.0001g），按照液料比30∶1（mL/g）加入体积分数为60%乙醇60 mL，称重，浸泡 24 h，分别按 10、20、30、40、50 min超声提取（35 kHz，250 W），冷却至室温，再称重，用乙醇溶液补足减失的重量，滤过，取上清液，测定总酚含量。

1.2.6 正交试验

选取粒径、液料比、乙醇体积分数、超声提取时间进行四因素三水平正交试验，考察各因素对总酚含量的影响，因素水平变见表1。

表1 因素和水平Table 1 Levels and factors of orthogonal test

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线的制作

绘制没食子酸吸光度与浓度的标准曲线，在2 μg/mL~8 μg/mL范围内，吸光值与质量浓度线性关系良好，拟合线性回归方程为：y=8.390 8x（y为质量浓度，x为质量浓度），r=0.999 5。

天麻总酚含量按下式计算：

式中：X为测定样品的天麻总酚含量，mg/g；A为测定液吸光值；A0为空白吸光值；V1为样品提取液体积，mL；50 为稀释倍数；V2为测定用样液体积，mL；m为样品质量，g。

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 粒径大小对天麻总酚含量的影响

天麻粉粒径对总酚含量的影响见图1。

图1 天麻粉粒径对总酚含量的影响Fig.1 Effect of particle size on content of total phenol

由图1可知，在20目～100目的粒径大小范围内天麻总酚含量随天麻粉粒径减小而增大，20目～60目范围内总酚含量增幅相对较大，60目时为3.74 mg/g，粒径目数大于60目以后总酚含量增幅较小，80目时达到最大值3.86 mg/g。但天麻粒径目数大于60目时提取液粘度增大，操作困难，因此选择天麻粉粒径60目作为最佳天麻粉粒径大小。

2.2.2 液料比对天麻总酚含量的影响

液料比对天麻总酚含量的影响见图2。

图2 液料比对天麻总酚含量的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on content of total phenol

由图2可知，随着液料比的增大，天麻总酚含量逐渐增加，当液料比为30∶1（mL/g）时达到最大值4.13 mg/g，因此选择液料比 30∶1（mL/g）作为最佳天麻总酚提取液料比条件。

2.2.3 乙醇体积分数对天麻总酚含量的影响

乙醇体积分数对天麻总酚含量的影响见图3。

图3 不同乙醇体积分数对天麻总酚含量的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on content of total phenol

由图3可知，当乙醇体积分数在40%～60%之间，总酚含量呈现递增趋势，乙醇体积分数为60%时达到最大值4.38 mg/g。当乙醇体积分数超过60%，总酚含量呈明显下降，这可能是由于部分天麻酚性成分亲水性较好造成，因此选择乙醇体积分数为60%作为最佳提取条件。

2.2.4 提取时间对天麻总酚含量的影响

提取时间对天麻总酚含量的影响见图4。

由图4可知，超声提取时间在10 min～30 min之间，天麻总酚含量呈小幅递增趋势，当超声时间为30 min时，含量最大，为4.38 mg/g，超声时间大于30 min，总酚含量呈现平稳趋势。整个提取时间对天麻总酚含量影响较小，这可能和样品在超声前浸泡24 h处理有关，主要部分已经在浸泡过程中已经提取出来，因此选择30 min作为最佳的超声提取时间。

图4 不同提取时间对天麻总酚含量的影响Fig.4 Effect of extraction time on content of total phenol

2.3 天麻总酚提取工艺优化

正交试验结果见表2。

表2 L9（34）正交试验结果Table 2 Results of orthogonal test

表2结果可以看出，以天麻总酚含量为指标，4个影响因子的极差R大小顺序为：C＞A＞B＞D。以极小值D因素为误差列进行方差分析（表3），C和A因素影响极显著，B因素影响显著。确定最佳提取工艺组合为：A2B3C1D2，即 60 目天麻粉，液料比 40 ∶1（mL/g），乙醇溶液浓度40%，超声提取30 min（35 kHz、250 W）。

2.4 优化工艺验证

按照优选的提取工艺进行3次验证试验。结果表明总酚平均含量为4.47 mg/g，RSD为1.24%，表明优选的提取工艺稳定性好，方法可行。

表3 总酚提取工艺方差分析Table 3 Variance analysis of extraction process on total polyphenols

3 结论

本研究采用超声波辅助提取和Folin－Ciocalteu比色法测定了天麻总酚含量。通过单因素和正交试验获得超声波辅助提取天麻总酚最佳工艺为：粒径大小为60目的天麻粉，液料比为40∶1（mL/g），乙醇体积分数为40%，超声提取30 min（35kHz、250 W）。在此条件下天麻总酚提取效率高，工艺稳定性好、结果准确可靠，工艺简单、可操作性强，是天麻总酚的理想提取方法。

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