关节软骨YKL⁃40表达水平与骨关节炎的相关性

关健 谢磊 丁罗宾 薛伟 王华军

1石家庄市第三医院关节外科（石家庄 050000）；2邯郸市中心医院骨科（河北邯郸 056000）；3暨南大学第一临床医学院，暨南大学附属第一医院骨关节外科（广州 510630）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种临床常见的退行性关节疾病，其发病率仅次于心血管疾病。随着全球人口老龄化的发展和肥胖人群的日益增加，OA在中老年人的患病率明显升高［1-3］。OA主要累及膝、髋等负重关节，病理表现为关节软骨退行性损伤与破坏，晚期出现关节疼痛、僵硬、畸形，关节活动功能障碍而致残。目前对于中晚期OA无疗效确切的治疗方案，不能逆转软骨的退变，最终只能行关节置换治疗。研究显示我国每年行膝关节置换的人数在5～7万，并逐年迅速上升［4］，造成了巨大的经济和社会负担。因此，早期诊断对OA的预防及治疗具有重要意义，目前生物标记物（biomarker）在OA的病理生理过程的作用越发受到重视［5-6］。其中，YKL⁃40是哺乳动物糖基水解酶家族18中的一种，分布于软骨细胞、滑膜细胞、人骨肉瘤细胞等。研究表明，YKL⁃40与关节软骨损伤关系密切，能反映OA炎症的严重程度［7］。目前YKL⁃40的研究主要集中在血清及关节液，但对关节软骨中YKL⁃40的报道较少，其与OA症状严重程度的相关性有待证实。本研究选择膝骨关节炎患者作为研究对象，采用X线K⁃L分级标准对患者膝关节病变情况进行分级，采用免疫组织化学法检测关节软骨中YKL⁃40的表达水平，探讨YKL⁃40水平与症状严重程度、软骨损伤程度、影像学分级之间的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集本院骨关节科住院并行全膝关节置换治疗膝关节骨性关节炎患者42例（OA组），其中男19例，女23例，年龄51～75岁，并按X线K⁃L分级标准分为3个亚组，其中Ⅱ级组12例、Ⅲ级组14例、Ⅳ级组16例。另选取因糖尿病足（3例）、下肢动脉硬化栓塞闭塞症（2例）、外伤（6例）需要截肢手术且术前X线K⁃L分级标准为正常的患者共11例作为对照组，男6例，女5例，年龄27～50岁。以西安大略和麦马斯特大学骨性关节炎指数（the western ontario and mcmaster universities os⁃teoarthritis index，WOMAC）作为评价膝关节骨性关节炎临床病变程度标准。

1.2 纳入标准 （1）符合膝骨性关节炎、糖尿病足、下肢动脉硬化闭塞症的诊断标准，同时保守3个月治疗效果不佳，有明确的手术指征；（2）同意行全膝关节置换或因外伤严重需行大腿截肢术，并签知情同意书；（3）经本院伦理委员会批准，经患者同意进入本研究。

1.3 排除标准 （1）膝关节周围骨折脱位史或手术史；（2）膝关节痛风、肿瘤、结核、感染等病史；（3）合并严重内科病情无法完成手术者。

1.4 分级标准 骨关节炎X线Kellgren⁃Lawrence分级标准（表1）。采用单盲法，遮盖患者基本信息，由2名经验丰富的影像学专家对患膝进行X线K⁃L标准分级及分组。有不同意见时，共同讨论决定。

表1 X线Kellgren⁃Lawrence分级标准Tab.1 The radiographic progression of OA was identified according to the K⁃L grading scale

1.5 主要试剂 （1）鼠抗人YKL⁃40多克隆抗体（美国R&D公司）；（2）即用型免疫组化EliVisionTMplus试剂盒：试剂A为反应增强液及试剂，试剂B为酶标抗小鼠/兔IgG聚合物（福州迈新生物技术开发有限公司）。

1.6 关节软骨YKL⁃40的检测方法 手术后留取患膝，由本院经验丰富的病理科医师取股骨内髁关节面软骨。所获得软骨标本用10%甲醛固定，石蜡包埋，切片至3 μm，用二甲苯脱蜡和酒精脱水。不锈钢高压锅高压高温抗原修复。用3%过氧化氢溶液浸泡切片，阻断内源性过氧化氢酶。分别滴加鼠抗人YKL⁃40多克隆抗体、反应增强液及酶标抗小鼠/兔IgG聚合物。用AEC显色，出现红色或棕色提示阳性显色，再用改良Carazzi苏木素液复染后，滴加水性封片剂封片，烤干后再用中性树脂胶加盖玻片二次封片。显微图像分析系统（Sample PCI）测定软骨内反应产物吸光度值，取均值为测定结果。

1.7 统计学方法 采用SPSS 18.0软件行相关的统计学分析，对关节软骨中YKL⁃40表达水平比较采用采用方差分析。数据采用均数±标准差或中位数的方式表示。两个指标间的相关性采用Pearson相关分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 表2显示的是研究对象的一般资料，全部膝骨关节炎患者按X线K⁃L分级标准分为3组，3组患者在年龄、性别、病程及BMI指数方面比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 关节软骨中YKL⁃40水平的表达 把OA组共42例患者关节软骨YKL⁃40表达水平与正常组相比较，独立t检验分析显示，OA组总的YKL⁃40的表达水平高于对照组（0.221 6±0.012 7vs.0.131 5±0.017 5），差异有统计学意义（P＜0.05，表3）。单因素方差分析显示，随着OA的X线K⁃L分级递增，OA患者关节软骨中YKL⁃40表达水平依次升高，Ⅳ级组高于Ⅲ、Ⅱ级组，差异有统计学意义（P＜0.05，表4）。

2.3 OA组关节软骨中YKL⁃40的表达水平与WOMAC评分的相关性

2.3.1 关节软骨中YKL⁃40的表达水平与WOMAC疼痛评分呈正相关r=0.639，P=0.001。见图1。

2.3.2 关节软骨中YKL⁃40的表达水平与WOMAC关节僵硬评分呈正相关r=0.565，P=0.001。见图2。

2.3.3 关节软骨中YKL⁃40的表达水平与WOMAC肢体功能评分呈正相关r=0.785，P=0.001。见图3。

2.3.4 关节软骨中YKL⁃40的表达水平与WOMAC总评分呈正相关r=0.863，P=0.001。见图4。

表2 一般资料Tab.2 Baseline data ±s

表2 一般资料Tab.2 Baseline data ±s

项目年龄（年）性别（女/男）患肢（左/右）病程（年）BMI（kg/m2）WOMAC疼痛评分WOMAC僵硬评分WOMAC功能评分WOMAC总分0级（n=11）39.71±17.82 5/6 4/7-23.05±2.06----Ⅱ级（n=12）56.53±6.15 7/5 4/8 7.28±2.18 22.97±2.38 11（8 ～ 16）4（3 ～ 6）29（25 ～ 35）42（35 ～ 60）Ⅲ级（n=14）58.14±6.51 8/6 5/9 7.57±3.01 23.56±2.71 14（9 ～ 18）6（5 ～ 8）42（37 ～ 55）58（48 ～ 70）Ⅳ级（n=16）57.35±7.14 8/8 7/9 8.04±3.29 23.36±2.08 16（12 ～ 20）＃7（7 ～ 8）＃55（45 ～ 60）＃80（65 ～ 95）＃

表3 正常组与OA组软骨YKL⁃40的水平表达（吸光度值）Tab.3 YKL⁃40 levels（μg/L）in normal group and OA group（absorbance value）±s

表3 正常组与OA组软骨YKL⁃40的水平表达（吸光度值）Tab.3 YKL⁃40 levels（μg/L）in normal group and OA group（absorbance value）±s

K⁃L分级正常组OA组例数11 42 YKL⁃40 0.131 5±0.221 6±t值-12.506 P值0.001

表4 OA组中3个亚组软骨YKL⁃40的水平表达（吸光度值）Tab.4 YKL⁃40 levels（μg/L）in 3 subgroups of OA group（absorbance value）±s

表4 OA组中3个亚组软骨YKL⁃40的水平表达（吸光度值）Tab.4 YKL⁃40 levels（μg/L）in 3 subgroups of OA group（absorbance value）±s

K⁃L分级Ⅱ级组Ⅲ级组Ⅳ级组例数12 14 16 YKL⁃40 0.172 6±0.016 4 0.218 7±0.018 8 0.274 2±0.025 1 F值P值134.1870.001

图2 软骨中YKL⁃40水平与WOMAC关节僵硬评分的相关性Fig.2 Association of AC YKL⁃40 levels（μg/L）with WOMAC stiffness scores

图3 软骨中YKL⁃40水平与WOMAC肢体功能评分的相关性Fig.3 Association of AC YKL⁃40 levels（μg/L）with WOMAC physical function scores

图4 软骨中YKL⁃40水平与WOMAC总评分的相关性Fig.4 Association of AC YKL⁃40 levels（μg/L）with WOMAC total scores

2.4 YKL⁃40与X线K⁃L分级的相关性 膝骨关节炎患者其关节软骨YKL⁃40表达水平与K⁃L分级有统计学相关性，关节软骨中YKL⁃40水平越高，K⁃L分级显示其OA越严重（r=0.372，P＜0.001）（图5）。

3 讨论

OA是一种慢性进展性关节疾病，多见于中老年人群，女性多于男性。流行病学调查显示，OA的总患病率约为15%，40岁人群的患病率为10%～17%，60岁以上为50%，75岁以上可达80%。在美国OA患者高达2 700万，到2030年预计将达到6 700万［8］。由于目前仍缺乏敏感性和特异性的方法用于OA的早期诊断与预防。核磁共振等影像学检查对于早期而尚未出现关节结构改变的OA不具有敏感性和特异性，且费用较高［9-10］。当患者出现症状或影像学征象的时往往已经是OA的中晚期。而现在还没有能够逆转软骨的退变的治疗方案，很多患者最终只能行关节置换来改善功能，缓解疼痛。2012年美国AAOS的研究显示：约450万患者行TKR，即超过50岁的人群中20个人中就有1个行TKR，每年仅行TKR的费用就超过130亿。OA已成为严重影响人类健康的重要公共卫生问题。监测早期OA关节软骨的病理变化是骨科领域目前研究的热点之一［11-12］。寻找能直接反映关节软骨早期病理变化的BM，对OA的早期诊断及预防具有重要的临床意义［13］。

关节软骨在病理状态下，生化改变要早于形态学改变。关节软骨的BM能够直接反映患病关节的关节骨、软骨及滑膜的代谢变化，揭示病情活动或预后，且关节软骨便于临床收集和检测，故研究关节软骨中的生物标记物以反映关节炎的病变有重要的临床意义。YKL⁃40是属于壳质酶蛋白家族的一种糖蛋白，可以反映细胞黏附、迁移和重组等内皮损伤的情况。已有研究证实：YKL⁃40在正常人体中的含量很低，但在OA患者软骨细胞中却大量存在，其着色主要存在于关节软骨的表层和中层的软骨细胞中。既往通过对血清及关节液中YKL⁃40的研究，学者们认为其可作为反映OA炎症程度与关节病变严重程度的指标［14-15］。VÄÄNÄNEN等［16］通过对100例患者关节液的检测证明关节液YKL⁃40与金属蛋白酶MMP⁃1、MMP⁃3和IL⁃6、IL⁃17呈相关性。VOLCK等［17］认为YKL⁃40源于关节中的软骨细胞、滑膜细胞和中性粒细胞，血清中的YKL⁃40水平受关节液中的浓度影响，后两者中的YKL⁃40水平反映软骨破坏情况及滑膜炎症程度，提示YKL⁃40与OA的发生相关。而目前研究主要集中在血清及关节液，对关节软骨中YKL⁃40的报道较少。在本研究中首次采用免疫组织化学法检测关节软骨中YKL⁃40的表达水平。结果显示膝关节炎患者的关节软骨YKL⁃40表达水平高于非膝关节炎患者，各组膝骨关节炎患者关节软骨YKL⁃40表达水平差异有统计学意义，Ⅳ级患者高于Ⅲ级、Ⅱ级患者。进一步证明了YKL⁃40与OA的发生关系密切。

图5 软骨YKL⁃40表达水平与X线K⁃L分级的相关性Fig.5 Association of AC YKL⁃40 levels（μg/L）with K⁃L grading scale

在本研究中，还发现随着膝关节骨性关节炎患者的X线K⁃L分级递增，Ⅱ级组、Ⅲ级组、Ⅳ级组患者关节软骨中YKL⁃40表达水平依次升高，差异有统计学意义。随着患者病情加重，X线K⁃L分级越高，膝关节退变越严重，YKL⁃40表达水平越高。这些结果显示YKL⁃40不仅与骨关节炎影像学严重程度相关，与患膝炎症程度、关节软骨退变程度等也有一定相关性。这可能与软骨组织在受到生物力学或者生物化学的刺激后反应产生更多的 YKL⁃40 有关［18-19］。CONNOR 等［20］研究也显示YKL⁃40表达的升高与关节软骨退变和骨赘生成的增加相关。进一步的研究显示YKL⁃40的表达水平与骨赘的长度呈正相关。国内研究人员［21-22］通过SD大鼠膝关节OA模型，观察OA早中期关节软骨YKL⁃40表达与软骨细胞凋亡率（apop⁃tosisindex，AI）的关系，结果也证实随着软骨退变加重，YKL⁃40的表达与软骨细胞AI呈正相关，提示YKL⁃40能反映出关节软骨降解破坏和滑膜炎症的程度［23-24］，可能为OA早中期病理过程中软骨细胞凋亡的重要影响因子。

同时本研究进一步探讨了关节软骨YKL⁃40水平与WOMAC评分间的关系，相关性分析显示，其表达水平与WOMAC疼痛、僵硬、肢体功能以及总分呈正相关。这结果表明YKL⁃40水平在一定程度上反映了OA患者关节WOMAC评分情况，尤其是在剔除了相应混杂因素如年龄、性别、BMI指数后，关节软骨YKL⁃40水平与上述评分仍显示二者有统计学相关性，说明关节软骨损伤退变与OA患者的疼痛、僵硬、关节功能等临床症状有密切的关系，前者可作为一种反映OA严重程度的生物标记物。

综上所述，本研究显示OA中关节软骨的YKL⁃40表达水平与X线K⁃L分级、WOMAC疼痛、僵硬、肢体功能以及总分呈正相关。随着OA的病情加重，关节软骨破坏增加，YKL⁃40表达水平越高，对OA的早期诊断、治疗或预测预后具有重要的意义，也为OA的早期诊断提供新的思路和依据。关节软骨中YKL⁃40参与了膝骨关节炎基本病理改变过程，可能成为一种新颖的预测疾病进展的生物标记物。

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