乳酸菌在抗病原微生物感染中的作用

赵晓雨，李 梦,唐金秀,朱洪伟,张建龙,姜琳琳,黄清荣,于 馨 ,张兴晓

(鲁东大学 生命科学学院，山东 烟台 264025)

乳酸菌是一类可以发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌统称，属革兰阳性菌(G+),通常包括乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)等。乳酸菌作为益生菌中的主要分类具有多种重要生理功能，如维持肠道微生态的平衡、促进肠道蠕动消化、抗高血压[1]、降低血清胆固醇[2]、黏附或降解有害物质等。1907年，俄国微生物学家Metchnikoff最先发现乳酸菌具有抑制腐败细菌生长及增强机体免疫力的功效。此后，乳酸菌在抑制病原微生物感染中的作用逐渐被重视。乳酸菌可通过增强机体免疫力、直接抑制病原微生物、增强上皮细胞屏障功能等途径抑制细菌和病毒感染。本文综述了乳酸菌在抗病原微生物感染中的作用。

1 增强机体免疫力

1.1 乳酸菌通过增强固有免疫抵御病原微生物感染

固有免疫是宿主防御病原微生物感染的第一道防线。固有免疫系统由具有免疫防御功能的体液因子和固有免疫细胞构成。其中体液因子包括抗菌肽、溶菌酶、补体系统、细胞因子和趋化因子等。固有免疫细胞主要包括吞噬细胞(包括单核/巨噬细胞和中性粒细胞)、NK细胞、T细胞、Bl细胞、NKT细胞、肥大细胞等。

乳酸菌可通过诱导固有免疫体液因子产生和增强固有免疫细胞功能来抵御病原微生物感染。天然抗菌肽不仅具有选择性免疫激活和调节功能，而且具有广谱抗菌活性[3]，可以杀灭革兰阴性细菌、革兰阳性细菌、真菌、寄生虫等。研究表明，植物乳杆菌ATCC 8014分泌的抗菌肽Tet213和细菌素对金黄色葡萄球菌、血链球菌和铜绿假单胞菌均有较强的抑制作用[4]。Gupta等[5]研究发现植物乳杆菌LR/14产生的抗菌肽AMPs LR14能够抑制恶性疟原虫的生长及由其引起的溶血现象。鼠李糖乳糖杆菌、乳酸球菌、明串珠球菌可使褐鱒血清溶菌酶水平显著升高，抗菌能力显著增强[6]。补体参与机体非特异性免疫的主要作用机制是通过裂解直接杀死病原菌。研究表明，给鱼类直接投喂乳酸菌可提高其自然补体的活性[7]。此外，乳酸菌还可以诱导增强单核细胞和巨噬细胞的活性，提高活性氧、活性氮含量及单核/巨噬细胞的吞噬能力[8]。Matsusaki[9]等发现，口服植物乳杆菌06CC2可以有效诱导肠道部位IFN-γ的产生，激活肠道免疫反应。进一步的研究表明，乳杆菌06CC2可以通过活化NK细胞促进IFN-γ的分泌。Zelaya等[10]用热灭活的鼠李糖乳酸杆菌CRL1510(Lr1510)对小鼠连续鼻腔给药，然后用流感病毒进行感染，实验结果显示，细胞因子IL-10和I型干扰素分泌显著增强，并且能引发小鼠抗病毒免疫反应和TLR3免疫反应，显著降低了小鼠因流感病毒引起的肺损伤。Kechaou等[11]通过大规模的筛选，确定了一种新型的候选乳杆菌株—植物乳杆菌CNRZ1997，能够有效诱导小鼠外周血单核细胞IL-8和IL-12等炎症因子的分泌，抑制IL-10的产生，增强机体抗流感病毒的免疫应答，显著降低体内病毒滴度。在大鼠李斯特单增菌感染模型中，唾液乳杆菌BGHO1可显著诱导小肠绒毛部位和派氏结部位固有免疫分子CD14、IL-1 和TNF-α的表达，增强抗细菌免疫应答，降低体内细菌载量[12]。

1.2 乳酸菌通过增强适应性免疫抵御病原微生物感染

适应性免疫主要包括体液免疫和细胞免疫。体液免疫由B淋巴细胞产生的抗体所介导。这些抗体包括IgA、IgG、IgM、IgE和IgD五种，能够识别并结合抗原、介导免疫细胞活性、调理吞噬等。Waki等[13]将冻干的短乳杆菌KB290通过灌胃的方式免疫小鼠，然后用流感病毒IFV对小鼠进行鼻内感染，结果表明，感染前口服KB290不仅能够显著提高IFN-α的分泌水平，而且能够诱导机体产生特异性IFV-IgA，从而减轻IFV引起的临床症状。此外，发酵乳杆菌CJL-112能够通过刺激巨噬细胞、Th1细胞产生大量的IgA诱导保护性免疫反应来保护小鼠免受流感病毒IFV的侵染[14]。给豚鼠口服能够表达口蹄疫病毒(FMDV)蛋白VP1的乳酸杆菌菌株NC8和WCFS1，能够显著诱导机体产生高水平抗原特异性IgG、IgA、IgM、黏膜分泌型IgA(sIgA)及中和抗体，增强体液免疫，有利于预防和治疗口蹄疫病毒感染[15]。在流感病毒感染中，Kikuchi等[16]从140株能够诱导小肠派氏结产生IgA抗体的乳酸杆菌菌株中筛选出了1株乳酸菌AYA，进一步研究发现，给小鼠口服乳酸菌AYA可显著诱导派氏结中DC细胞分泌IL-6，进而促进IgA+B细胞分化为浆细胞，并产生大量IgA，增强肠道黏膜免疫功能。此外，该乳杆菌也能诱导肺部IgA的产生。

乳酸菌除了可以促进机体产生特异性抗体外，还能增强机体针对病原微生物的细胞免疫应答。肺炎病毒感染中，在肺黏膜部位利用植物乳杆菌L.plantarumBAA-793对小鼠进行免疫，可显著诱导中性粒细胞、DC细胞及淋巴细胞募集至感染部位，通过增强抗原递呈和特异性免疫应答以降低病毒滴度。同时，该乳杆菌可明显抑制肺炎病毒诱导的炎症反应[17]。Yang等[18]使用能够表达H9N2禽流感病毒相关蛋白NP-M1-DCpep的重组乳酸菌口服疫苗NC8-pSIP409-NP-M1-DCpep对鸡进行免疫，再予H9N2病毒感染。结果表明，该重组乳酸菌可显著增强T细胞介导的细胞免疫，同时提高黏膜分泌型sIgA和IgG水平，对鸡具有良好的保护效果。

综上，乳酸菌可以通过增强机体固有免疫和适应性免疫促进机体对细菌和病毒的清除作用，以抵御病原微生物的感染(图1)。

图1 乳酸菌通过增强机体免疫力抵御病原微生物感染Fig.1 Lactic acid bacteria can resist the infection of pathogenic microorganisms by enhance the immunity of the organism

2 抑制病原微生物

2.1 与病毒结合抑制病毒吸附

病毒的复制周期主要包括吸附、穿入、脱壳、生物合成、组装和释放这几个连续过程。吸附是病毒与宿主细胞相互作用的第一步，是病毒感染致病的前提。乳酸菌可以直接与病毒表面分子结合抑制病毒吸附于易感细胞表面。人类免疫缺陷病毒(HIV)可选择性感染表达CD4分子的细胞，如CD4+T细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞等。这些细胞表面的CD4分子可以和HIV囊膜蛋白gp120结合，介导病毒吸附至细胞表面。Su等[19]研究发现，干酪乳酸菌393(L.casei393)表面也存在着CD4受体，可以直接结合HIV表面的gp120蛋白，占据其与CD4+细胞结合位点，进而抑制HIV吸附和感染宿主细胞。体外实验表明，L.casei393可显著抑制TZM-bl细胞感染HIV-1，且抑制率高达60%～70%，提示乳酸杆菌可以通过直接结合病毒以降低机体病毒滴度。

2.2 竞争占位作用

乳酸菌除了能够与病毒结合抑制病毒对细胞的吸附外，还能够和宿主细胞表面相结合，减少病原菌的黏附位点，从而减弱致病菌与肠黏膜间的相互作用[20]，这种作用方式也叫竞争作用或空间位阻效应。体外竞争抑制实验和取代实验表明，卷曲乳酸杆菌K313和K243可明显抑制沙门氏菌H9812和大肠埃希菌ATCC25922对肠上皮细胞HT-29的黏附，提示乳酸菌能够和肠道病原菌竞争结合位点，进而抑制病原菌的黏附和感染[21]。Garriga等[22]筛选了5株乳酸菌，发现其中鼠李糖乳杆菌CTC1679和米酒乳杆菌CTC494具有较强的结合HT-29细胞的能力，进而抑制李斯特单增菌黏附于细胞表面。此外，从泡菜中分离的乳酸菌嗜酸乳杆菌GK20、副干酪乳杆菌GK74和胚牙乳杆菌GK81能够与鼠伤寒沙门氏菌竞争性结合结肠腺癌细胞Caco-2表面结合位点，导致鼠伤寒沙门氏菌感染能力显著降低[23]。

2.3 产生代谢产物发挥抑制作用

乳酸菌可产生有机酸、过氧化氢、安息香酸、溶菌酶等物质对病原微生物发挥抑制作用[24]。乳酸菌产生的乳酸、乙酸等有机酸能够降低肠道pH值、鳌合金属离子、改变肠道黏膜的通透性，从而抑制病毒增殖和病原菌感染。Nahui等[25]从健康女性阴道内提取了5株乳杆菌，实验表明，这几株乳杆菌均能通过产生乳酸和介导介质的酸化显著抑制HIV-1的感染。此外，卷曲乳杆菌L.crispatusT79-3、T90-1和詹氏乳杆菌L.jensenii118-3、T231-1产生的乳酸对阴道内寄生的大肠埃希菌的生长和定殖有显著抑制作用[26]，植物乳杆菌L.plantarumMTCC 2621产生的乳酸对金黄色葡萄球菌的生长有显著抑制作用[27]。此外，保加利亚乳杆菌和唾液链球菌代谢产生的乳酸对代表性口臭致病菌牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌也有明显的抑制作用[28]。

除乳酸外，乳酸菌还可以分泌过氧化氢提高宿主抗菌肽(溶菌酶和乳铁蛋白)的活性和上皮细胞的抗菌活性，以保护阴道不受感染[29]，且宿主体内过氧化氢浓度的变化和乳酸菌代谢产物溶菌酶的活性对大肠埃希菌的抑菌作用成正比[30]。此外，有些乳酸菌还可以产生细菌素，可直接作用于病原微生物，抑制其感染和增殖。乳酸菌产生的细菌素对淋病奈瑟氏菌的生长有抑制作用[31]。植物乳杆菌产生的细菌素可以抑制肉杆菌、金黄色酿脓葡萄球菌、铜绿假单胞菌、李斯特菌和沙门氏菌的生长繁殖[32]。有些乳酸菌还可以产生胞外多糖，吸附病毒表面受体临近的分子，降低病毒对细胞的氧化损伤。例如将乳酸菌培养上清与鸡胚成纤维细胞(CEF)共同孵育后再用鸡传染性支气管炎病毒(IBV)进行感染，可以显著提高细胞的抗氧化能力，推测可能是乳酸菌培养上清中的多糖吸附细胞表面病毒受体邻近的分子，产生空间位阻效应而减少病毒对细胞的吸附和在细胞内的增殖，从而降低了病毒对细胞的氧化损伤[33]。不仅如此，胞外多糖可以诱导小鼠树突状细胞的成熟，进而诱导T细胞免疫应答[34]。另外，乳酸菌可以分泌胞外多肽抑制革兰阴性菌胞壁成分LPS介导的炎性损伤，并且这种抑制作用是NF-κB和p38MAPK信号通路依赖的[35]。 乳酸菌可分泌抗菌肽，增强固有免疫抑制细菌感染。

综上，乳酸菌可通过与病毒表面位点结合抑制病毒吸附至易感细胞表面、与细菌竞争结合肠上皮细胞位点或产生抑制性代谢产物等途径发挥抑制病原微生物感染宿主细胞的作用(表1)。

3 增强肠道上皮细胞屏障功能

肠上皮屏障包括肠上皮细胞(IECs)表面的理化屏障、上皮细胞层、上皮细胞间的紧密连接(tight junctions,TJs)。IECs一方面可以分泌碱性磷酸酶(intestinal alkaline phosphatase,IAP)、抗菌肽及黏蛋白，在肠道上皮细胞表面形成一层理化屏障，防止病原微生物黏附，另一方面可通过TJs调控细胞旁路运输，以维持上皮完整性。从犬肠道中分离的嗜酸乳杆菌LAB20有较强的黏附能力，能够通过增加跨膜电阻(Transepithelial electrical resistance，TER)来增强肠道上皮细胞的屏障功能，而且该菌株还具有抗炎能力，能够诱导HT-29细胞IL-8的分泌[36]。

3.1 促进黏蛋白分泌

肠道上皮细胞中的杯状细胞可分泌富含黏蛋白的黏液，将IECs与病原微生物隔离，抑制致病菌在肠上皮定植。此外，黏液中含有与上皮细胞表面细菌结合受体相似的蛋白分子，与细菌结合后抑制其在上皮细胞的定植。实验表明，乳酸菌可诱导HT29细胞表达黏蛋白3(mucin 3，MUC3)，增强乳酸菌和细胞之间的黏附，从而减少病原菌对细胞的黏附[37]。同样，嗜酸乳杆菌能够通过促进黏蛋白2的分泌抑制大肠埃希菌O157∶H7对HT29细胞的黏附[38]。

3.2 促进紧密连接形成

紧密连接是由细胞膜构成的一个细胞间紧密相连的区域，是多种蛋白组成的复合蛋白，具有降低上皮细胞通透性，隔离水分、电解质和病原微生物的作用。病原微生物感染可破坏细胞间的紧密连接，增加肠道通透性，导致细菌或病毒进入机体。Beck等[39]利用比目鱼模型进行研究发现，饲喂乳球菌BFE920可促进肠道分泌IL-10、TGF-β 等免疫调节分子，进而促进闭合蛋白和紧密连接的形成，降低肠道通透性，对迟钝爱德华菌感染具有良好保护作用。胚芽乳杆菌DSM 2648能够通过增强紧密连接完整性降低大肠埃希菌O127∶H6感染[40]。

3.3 抑制肠道上皮细胞凋亡

肠道上皮细胞的完整性对于机体抵御病原微生物的感染至关重要，乳酸菌能够通过多种机制抑制IECs的凋亡，维持细胞的完整。有研究表明，加氏乳杆菌SF1183能够促进结肠癌细胞株HCT116中周期调控蛋白p21的表达将细胞周期阻止于G1期，进而抑制细胞凋亡[41]。鼠李糖乳杆菌LGG及其培养上清可以通过活化Akt抗凋亡信号通路和抑制p38MAPK促凋亡信号通路抑制肠上皮细胞的凋亡[42-43]。

表1 乳酸菌抑制病原微生物作用及其机制Table 1 Inhibitory effect of lactic acid bacteria on pathogenic microorganisms and its mechanism

4 结 语

乳酸菌抗病原微生物的作用最终取决于乳酸菌、病原微生物和宿主三者之间的复杂相互关系。随着对乳酸菌研究的深入，人们筛选出了更多具有抗菌抗病毒作用的菌株，菌株的抗病毒谱也已由最初的轮状病毒(RV)扩展到HIV、流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、水泡性口炎病毒(VSV)等。本实验室前期研究中从感染并耐过禽流感病毒H9N2的鸡鼻腔黏液中分离出1株唾液乳杆菌和1株植物乳杆菌，实验发现该菌对流感病毒的复制具有明显抑制作用。进一步研究发现，这种抑制作用与其高疏水性及对上皮细胞的高黏附性密切相关。但是，有关该乳杆菌与流感病毒的结合位点及抗病毒机理尚需进一步研究。近年来乳酸菌作为新型微生态制剂广泛用于治疗临床疾病，但尚存在诸多问题。有报道称益生菌可引起细菌异位，增加重症急性胰腺炎的死亡风险[44]，而且部分乳酸菌携带可转移耐药基因，增加肠道菌群中耐药性水平转移的风险[45]。此外，乳酸菌抗病原微生物的细胞学机制和分子学机制尚未完全阐明，临床中如何更好地利用乳酸菌对感染性疾病进行治疗仍需进一步探索。