文冠果果壳醇提物不同部位总多酚含量及其抗氧化活性研究

李国倩 秦天 黄蓉 唐祥 杨春艳 周春阳

[摘要] 目的 建立文冠果果壳醇提物总多酚含量（TPC）测定方法，并评价文冠果果壳醇提物不同部位总多酚含量和体外抗氧化活性。 方法 采用分光光度法测定文冠果果壳总多酚的含量；采用ABTS和DPPH自由基评价文冠果果壳多酚的抗氧化活性。 结果 文冠果果壳总多酚含量为10.22 mg/g。D101大孔树脂纯化后，多酚主要集中在30%乙醇洗脱部位（4.92 mg/g）。该部位ABTS和DPPH自由基的IC50值分别为（4.83±0.33）、（9.33±0.23）μg/mL；阳性对照芦丁对ABTS和DPPH自由基的IC50值为（12.87±0.21）、（10.29±0.17）μg/mL。 结论 文冠果果壳醇提物大孔树脂30%乙醇洗脱部位的总多酚含量最高，抗氧化活性最强，值得进一步开发利用。

[关键词] 文冠果；总多酚含量；正交试验；抗氧化活性

[中图分类号] R284.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）12（a）-0027-06

文冠果（Xanthoceras sorbifolia Bunge）又名木瓜、文登阁、僧灯毛道，隶属于无患子科文冠果属（Xanthoceras）植物，一属一种，灌木或乔木，分布于我国甘肃、辽宁、河北、陕西等省。文冠果为我国北方特有的木本油料作物，有“北方油茶”之称，具有较高的经济价值和药用价值[1]。文冠木（文冠果的干燥心材）曾列入《中华人民共和国药典》（1977年版），主要用于治疗类风湿性关节炎、风湿内热和皮肤风热等症[2]。

文冠果果壳是一种农业废物，主要含有多酚[3]和皂苷[4]类成分，具有改善学习记忆功能、抗癌、抑制酪氨酸酶、治疗心脑血管疾病、抗氧化、抗炎和抑制胰脂肪酶活性等多种生物活性[5-7]。目前，文冠果果壳总多酚的含量[8]、抗氧化活性的相关研究鲜见报道。因此，本研究采用单因素实验和正交实验[9]确定文冠果果壳总多酚含量测定的最佳显色条件；采用该显色条件评价文冠果果壳醇提物经D101大孔树脂纯化前后不同部位的总多酚含量；采用ABTS和DPPH自由基评价文冠果果壳醇提物不同部位的抗氧化活性。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UV-1750型紫外分光光度计（日本岛津公司）；FA2004分析电子天平（0.0001 g，上海良平仪器仪表有限公司）；KQ-300DE型台式数控超声波清洗器（东莞市科桥超声波设备有限公司）；HH-9数显恒温水浴锅（金坛市国旺实验仪器厂）。

1.2 试药

没食子酸（批号：20120227，HPLC≥98%，成都市科龙化工试剂厂）；芦丁（批号：MUST-16111111，HPLC≥98%，成都曼斯特生物科技有限公司）；DPPH（批号：034K1071，HPLC≥98%，Sigma）；ABTS（201406，HPLC≥98%，Aladdin）；水为自制超纯水，钨酸钠（批号：20161 227，上海中秦化学试剂有限公司）、钼酸钠（批号：201 41119，天津市化学试剂四厂）、硫酸锂（批号：20160 409，天津市巴斯夫化工有限公司）等试剂均为分析纯。

文冠果果壳采自甘肃省白银市，经中国科学院兰州化学物理研究所戚欢阳副研究员鉴定为无患子科文冠果属植物文冠果（Xanthoceras sorbifolium Bunge）的果壳。

2 方法与结果

2.1 总多酚含量分析

2.1.1 对照品溶液的制备 准确称取10.0 mg干燥的没食子酸，加蒸馏水适量，超声溶解，放冷，以蒸馏水定容至100 mL，制成每毫升含0.1 mg没食子酸的溶液，即为对照品溶液，4℃冰箱保存备用。

2.1.2 福林试剂的配制 参照文献[10]配制，贮于棕色瓶中，4℃冰箱保存备用。

2.1.3 供试品溶液的制备 取文冠果果壳粉300.1 g，70%乙醇（料液比为1∶10），60℃超声提取3次（每次60 min），得文冠果果壳醇提物（XST）53.3 g，4℃冰箱保存备用。取该文冠果果壳醇提物48.3 g进行D101大孔吸附树脂柱层析，分别采用水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和95%乙醇依次进行洗脱，得到水部位（XSW）37.2 g，30%乙醇洗脱部位（XS30%E）3.2 g，50%乙醇洗脱部位（XS50%E）4.4 g，70%乙醇洗脱部位（XS70%E）2.9 g，95%乙醇洗脱部位（XS95%E）0.8 g。各部位4℃冰箱保存备用。精密称取XST、XSW、XS30%E、XS50%E、XS70%E和XS95%E各0.14 g，加超纯水溶解并定容至100 mL，抽滤后备用。

2.1.4 检测波长 取按“2.1.1”配制的对照品溶液适量，稀释5倍，精密吸取该对照品溶液和所配供试品溶液各0.2 mL，分别置于5 mL容量瓶中，加入1 mL超纯水，摇匀，加入福林试剂0.5 mL，摇匀，放置1 min；加入10%碳酸钠溶液1 mL，加水稀释至刻度，充分摇匀后置于60℃的恒温水浴锅中反应60 min，以超纯水为空白，于550～850 nm下扫描，记录紫外光谱图。

文冠果果壳多酚提取溶液和没食子酸对照品溶液与Folin-Ciocalteu试剂反应后分别在波长762、764 nm处有稳定的最大吸收峰（图1），故确定检测波长为762 nm。

2.1.5 线性关系的考察 取按“2.1.1”配制的对照品溶液适量，稀释5倍，精密吸取该对照品溶液0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.25 mL，按照“2.1.4”方法，于762 nm 波长处测定各吸光度值（A）。以A值为纵坐标，对照品溶液浓度C为横坐标作图，绘制标准曲线，得到回归方程为Y=0.1298X+0.0583（R2=0.9981）。沒食子酸浓度在1.2～5.0 mg/L范围内与其吸光值呈现良好的线性关系。标准曲线见图2。

2.1.6 单因素试验 分别精密量取供试品溶液0.2 mL，按“2.1.4”项下方法显色，采用单因素优化法分别对体系中显色时间（20、40、60、80、100、120 min）、显色温度（30、40、50、60、70、80、90℃）、福林试剂用量（0.25、0.4、0.5、0.6、0.7、0.9 mL）、10%碳酸钠溶液用量（0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75 mL）对总多酚含量测定的影响进行考察（以上实验均平行测定3次）。

从图3A可以看出，反应80 min后，文冠果果壳醇提物吸光度值变化不明显。因此，确定最佳显色时间为80 min。反应温度超过70℃后，吸光值逐渐降低（图3B），提示多酚类化合物在高温下不稳定。因此，确定最佳的显色温度为70℃。当Folin-Ciocalteu试剂用量为0.5 mL时，吸光度值达到最大值（图3C）。因此，确定Folin-Ciocalteu试剂的最佳用量为0.5 mL。文冠果果壳醇提物的吸光值随碳酸钠溶液加入量的增加而升高，但当加入量>1.0 mL时，吸光度值逐渐降低，故确定10%碳酸钠溶液的最佳加入量为1.0 mL（图3D）。

2.1.7 正交实验 在单因素实验的基础上选取显色时间、显色温度、福林试剂用量、10%碳酸钠用量，测定文冠果果壳醇提物中总多酚的含量，以优化文冠果果壳醇提物多酚类化合物的最佳提取工艺。设计正交实验，见表1。

根据正交试验结果，文冠果果壳总多酚含量测定的最佳显色条件为：显色温度60℃，显色时间100 min，FC试剂用量0.6 mL，10%碳酸钠溶液用量0.75 mL。见表2～3。

2.1.8 稳定性试验 分别取同一供试品溶液0.2 mL，按照文冠果果壳总多酚含量测定的最佳条件，显色后室温下放置，于15、30、45、60、90、120 min测定吸光度，并计算总多酚含量，显色后2 h内的吸光度RSD为0.09%。提示供試品溶液在室温下2 h内稳定。

2.1.9 精密度试验 分别准确吸取同一供试品溶液0.2 mL，共5份，分别置5 mL容量瓶，按文冠果果壳总多酚含量测定的最佳条件，测定吸光度，并计算总多酚含量，RSD为0.04%，提示仪器精密度良好。

2.1.10 重复性试验 分别精密称取文冠果果壳粉末0.5 g左右，按照供试品溶液的制备方法，平行制备5份供试品溶液。取供试品溶液0.2 mL，按文冠果果壳总多酚含量测定的最佳条件，测定吸光度，计算文冠果果壳总多酚平均含量为10.22 mg/g，RSD为0.85%，提示该方法重复性较好。

2.1.11 回收率试验 分别精密称取文冠果果壳粉末6份，每份0.5 g左右，各加入精密称取的10 mg左右的没食子酸对照品，再按“2.13”制备供试品溶液，测定没食子酸含量，计算回收率，RSD为1.04%。见表4。

2.1.12 含量测定 样品按“2.1.3”项制备供试品溶液，并按正交实验所得最佳含量测定方法测定总多酚含量。

文冠果果壳70%乙醇提取物通过D101大孔吸附树脂纯化后，其总多酚主要集中在30%乙醇洗脱部位和50%乙醇洗脱部位，尤其是30%乙醇洗脱部位。见表5。

2.2 抗氧化活性测定

文冠果果壳各提取部位对ABTS和DPPH自由基的捕获活性通过采用文献[11]上的方法进行测量。

以芦丁为阳性对照，芦丁、XST、XS30%E和XS50%E在100 μg/mL时具有较强的抗氧化活性；随后进行了这些部位的IC50测试，显示阳性对照芦丁对ABTS+和DPPH自由基的半数捕获浓度分别为（12.87±0.21）、（10.29±0.17）μg/mL；XST、XS30%E和XS50%E对ABTS+自由基的半数捕获浓度分别为（104.8±0.07）、（4.83±0.33）、（15.42±0.17）μg/mL；XS30%E和XS50%E对DPPH自由基的半数捕获浓度分别为（9.33±0.23）、（32.11±0.16）μg/mL。见图4。

3 讨论

福林酚法检测多酚含量简便易行，显色灵敏、范围宽且稳定，具有较好的精密度、准确度和特异性[12-13]。多酚主要包括黄酮、酚酸和其他的多酚（包括芪类和木质素），其结构特征是至少有一个芳香环，而且芳香环上有一个或多个羟基[14]。多酚类物质最重要的功能是抗氧化和清除自由基[15]，对心血管类、糖尿病等疾病，如动脉粥样硬化[16-18]、心绞痛[19]、脑梗死[20]、心肺衰竭[21]、糖尿病肾病[22]等具有良好的疗效。该功能与多酚的结构有关，酚羟基可提供活泼氢使自由基灭活，本身被氧化形成含有邻二酚结构的自由基而具有较高的稳定性[23]。本研究采用ABTS、DPPH评价总多酚的抗氧化活性，其操作简便、结果准确、响应灵敏；缺点是该方法是一种体外检测方法，对于真实的生理环境只能尽可能接近，却无法真正模拟，故一般抗氧化研究都会选取两种以上的方法来共同说明某物质的抗氧化能力[24-25]。

本研究表明，文冠果果壳醇提物通过D101大孔吸附树脂纯化后，30%乙醇洗脱部位的抗氧化活性最强，比阳性药芦丁的抗氧化活性还强，提示抗氧化活性成分主要集中在30%乙醇洗脱部位。此外，本研究表明D101大孔吸附树脂对文冠果果壳中的多酚类抗氧化剂具有较好的分离富集效果。既往研究[11]显示，文冠果果壳中的多酚类主要包括表儿茶素、槲皮苷、芦丁、杨梅素-3-O-β-D芸香糖苷、槲皮素、原儿茶酸、儿茶素等。由此推测，30%乙醇洗脱部位强大的抗氧化能力有可能是多种多酚类抗氧化剂协同作用的结果。

氧化应激在多种疾病的发生发展中起着重要的作用[26-27]，是动脉粥样硬化的重要发病机制[28-30]。因此，本研究为文冠果果壳在保健食品，尤其是药品领域中的进一步开发利用提供参考依据。

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（收稿日期：2018-05-14 本文编辑：王 蕾）