IVC独立送风系统在裸鼠繁育中的应用及其效果分析*

刘勇 赵龙 张凡 柏合

【摘要】 目的：探究在裸鼠繁育中应用IVC独立送风系统的效果。方法：自2016年6月从本校医药研究中心SPF级动物室中，选择一间约20 m2的房间，在无特殊病原微生物（SPF）屏障系统的基础上安装IVC独立送风系统，作为研究组；另选择相同大小的房间，仅安装SPF屏障系统，作为对照组。研究起始，对照组与研究组都放置6只雌鼠（nu/+）与6只雄鼠（nu/nu），按照雌雄比1︰1的比例合笼。截止到2017年12月，统计两组的分娩间隔、平均每胎产仔数、存活率。结果：两组的分娩间隔、平均每胎产仔数比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；研究组的存活率显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：在裸鼠的繁育过程中应用IVC独立送风系统，能够显著提升裸鼠的存活率，从而能为临床动物实验提供更多优质可用的实验动物。

【关键词】 裸鼠； SPF屏障系统； IVC独立送风系统； 分娩间隔； 存活率

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.29.007

作为一种存在先天性免疫缺陷的实验动物，裸鼠的免疫力低下是由于T细胞的缺失所造成的。裸鼠需要在无特殊病原微生物（specific pathogen free，SPF）级以上的环境中生长。管理中稍有不慎就会导致种群的死亡与污染[1]。正因为如此，裸鼠的繁育饲养成为困扰研究人员的重大问题。裸鼠最重要的三个特征是无毛（hairless）、无胸腺（athymus）和裸体（Naked）。原种的裸鼠表现出无鼻毛的特征，足尖常常处于收缩的状态、螺旋样畸形。性成熟的雌性裸鼠没有规律的发情周期，卵巢比较小，注射hCG后无法促进其排卵。除了雌性裸鼠在生殖方面有缺陷外，雄性裸鼠经常产生畸形的精子，活动力低下，因此原种裸鼠的生育力极低[2]。新生的裸鼠刚开始的生长速度和正常小鼠没有明显差异，但在3周后，约是离乳的时间，裸鼠的生长速度显著迟缓，普遍表现出肝脏疾病，死亡率较高，平均寿命在14～25周。经过优化育种后的远交系无胸腺裸体小鼠在外形上看，与原种一致，全身接近于无毛，有时可在裸鼠的背部见到稀疏的带状毛，皮薄、褶皱较多[3]。为提高裸鼠的存活率、纯合裸鼠（nu/nu）的获得率，本研究中心引入独立送风系统（individual ventilated cages，IVC），探究独立送风系统在裸鼠繁育中的应用，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 2016年6月本校医药研究中心从北京实验动物研究所购入12只雌鼠（nu/+）、12只雄鼠（nu/nu），所选种鼠均为8周大。研究起始，对照组与研究组都放置6只雌鼠（nu/+）与6只雄鼠（nu/nu），按照雌雄比1︰1的比例合笼。

1.2 方法 从本校医药研究中心SPF级动物室中，选择一间约20 m2的房间，在SPF屏障系统的基础上安装IVC独立送风系统，作为研究组；另选择相同大小的房间，仅安装SPF屏障系统，作为对照组。

1.2.1 独立送风系统的安装与使用 研究组所使用的独立送风系统购自苏州市猴皇动物实验设备科技有限公司，产品型号为MKS-112，厂家安排专业的工人上门安装。裸鼠放置在配套使用的过滤帽鼠盒与层流柜。IVC独立送风系统的良好运行，关键在于送、排风系统的设计与安装。以国外先进设备为基础，将动物福利考虑在内，IVC笼盒内的空气流向应该使得过滤净化后的空气均匀平稳的分布在内，构成正压风幕，避免过强气流的产生。

1.2.2 裸鼠的饲养 （1）两组室温变化范围控制在21～25 ℃。照明时间统一设定为光照12 h，黑暗12 h。空气中的相对湿度控制30%～50%。（2）按照由低至高的不同级别设定空气净化与过滤装置，三组空调交替完成过滤的任务[4]。（3）所用的生长繁殖饲料购买自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。饲料原料有豆渣、鱼粉、啤酒酵母粉、植物油、玉米、小麦、麦麸、磷酸氢钙、石粉、铁、铜、锰、锌、维生素A、维生素D、维生素E、维生素B1、泛酸等。最终饲料中各种营养物质的终浓度为：水分10%，粗蛋白23.59%，粗纤维2.1%，粗脂肪5.01%，粗灰分7.68%等。饲料买来之后，由于裸鼠过于低下的免疫力，需要对其进行放射的灭菌处理（Co60）。自由摄入，定期添补。每周可适量添加熟鸡蛋黄、生瓜子[5]。（4）饮用水经过净水器（四季沐歌MU-Q01净水机）处理后，用盐酸将pH值调至3.5左右，并在水中加入適量的浓缩鱼肝油粉（武汉远成共创科技有限公司生产）。自由摄入，定期添补。（5）每周更换一次垫料。

1.2.3 饲养注意事项 研究人员进入鼠房内，应穿着灭菌后的实验服，并佩戴无菌口罩、帽子、乳胶手套。

1.2.4 饲养记录 裸鼠到达研究中心时即建立表格，将笼号详细的记录清楚，便于后续统计数据。

1.3 观察指标 每日上午9点至10点观察裸鼠繁育情况。从每只雌鼠生下第一窝仔鼠开始记录，截止到2017年12月底，统计两组的分娩间隔、平均每胎产仔数，以及统计8周后的存活率。

1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

对照组的分娩间隔为（41.2±2.7）d，研究组为（43.7±2.8）d，两组比较差异无统计学意义（t=1.986，P=0.064）。对照组平均每胎产（7.8±1.4）只，研究组平均每胎产（7.9±2.8）只，两组比较差异无统计学意义（t=2.012，P=0.071）。仔鼠出生8周即性成熟后，对仍健在的新生裸鼠数进行统计分析，对照组的存活率为（76.9±3.4）%，显著低于研究组的（86.4±1.7）%，差异有统计学意义（t=-6.122，P<0.001）。

3 讨论

20世纪60年代，在英国的一家医院里，一位医生无意间在非近交系小鼠中发现几只没有毛发包被的小鼠。同年代，有学者证明了这种没有毛发的小鼠的产生是由于染色体上的等位基因突变所造成的[6]。对这种小鼠的皮肤组织与正常小鼠的皮肤进行组织学分析，发现结构有异常，经证明是常染色体退化导致的，因此得名“裸体（Nude）”，“nu”是其突变的基因符号，可惜当时没有引起大众的注意[7]。此后，当研究人员发现裸鼠不具有胸腺，这才吸引了医学与生物学相关的研究人员的关注。在裸鼠被发现之前，用动物模型去进行免疫学的研究，一般选择的是给小鼠注射抑制T细胞的药物，或者是手术摘除胸腺。由于藥物对T细胞的抑制作用不完全，手术的副作用过多，关于免疫学的研究进展处于一个缓慢前进的状态。而裸鼠的发现，为免疫学的研究与进展提供了一个理想的实验动物模型[8]。

因为裸鼠原种过于低下的免疫力，寿命短，生育率也较低，无法大规模的应用于实际的研究工作。目前在裸鼠的繁育过程中不用nu/nu雌鼠，因其繁殖性能低，一般采用杂合子交配方式或隐性纯合子雄性与杂合子雌鼠交配。这种交配方法，其后代将出现表现型正常的仔鼠和裸鼠，比例为1︰1。为了改良这些缺点，人们将原种裸鼠与其他种群的小鼠杂交，一代代繁育，最终获得了寿命较长、生育率好、免疫力能耐受SPF的远交系无胸腺裸体小鼠，得以广泛应用[9]。

因为没有T细胞维持免疫力，繁育裸鼠所用的饲料、所处环境要求条件较为严格。国外的研究人员经过多年的繁育，得出了一定的经验。裸鼠的繁育条件采用无特定病原体（SPF）级，饲养条件选定为屏障系统或隔离系统[10]。但是一些发生在裸鼠中的传染性疾病也有所报道。各国根据自己的实际需要，在自身条件的基础上建立了相应的质量控制方法，大力促进了裸鼠繁育工作和以裸鼠为实验动物的其他相关学科的飞速发展[11]。

裸鼠的淋巴细胞与正常的淋巴细胞状态不同，由于胸腺的异常，进而引发T细胞由无活性的状态到有活性的转变出现障碍[12]。虽然B细胞、T细胞的前体是正常的，由于胸腺不存在，因此无形成有功能的正常的T细胞[13]。因为不存在胸腺，裸鼠的免疫反应是不完整的、异常的，是一种免疫缺陷动物。胸腺分布于健全的小鼠的胸骨柄的后方，毗邻气管、位于心脏的腹面，胸腺分左右两叶，外形呈现乳白色脂肪状。机体免疫功能的正常与否，与胸腺有着密切的关系，有研究可以证明，胸腺能够分泌多种表现出生物活性的多肽类物质，统称为胸腺素[14]。胸腺素能够促使淋巴组织增殖分化形成新的淋巴细胞；胸腺素已被证实同机体免疫技能有密切的关系，能够促进来自其他组织的原始淋巴细胞转变成有免疫活性的T淋巴细胞，进而发挥免疫功能。

为了防止基因突变以恢复裸鼠的免疫功能，常在裸鼠中应用多种免疫学检测方法来证明其T淋巴细胞处于缺陷的状态[15]。例如，使用羊红细胞或者是地鼠的红细胞反复免疫，T淋巴细胞的免疫功能没有得到恢复，如果再用三硝基苯基修饰过的上述两种红细胞进一步免疫，裸鼠体内没有产生三硝基抗体，则证明还是原来的裸鼠。除了应用红细胞进行验证，用狂犬活疫苗对裸鼠与正常小鼠进行验证，关于血清中抗体的产生、或者是抗体本身的功能，裸鼠与正常小鼠呈现出不一样的趋势，通过该种处理的正常小鼠能表现出良好的免疫功能，而裸鼠无法产生可被检测到的免疫反应[16]。

IVC独立送风系统，是应用于小型啮齿类实验动物饲养的新一代SPF级、净化通气的饲养装备，可以取代传统实验动物饲养的屏障、净化系统。近些年来在国内许多以小型啮齿类动物为研究对象的研究室，IVC的应用越来越广泛。这种在SPF级别上加装的空气净化设备，即不同于过去那种完全的屏障，也不同于开放环境下的IVC安装。与单纯的SPF级屏障系统做比较，三级净化空调机组耗电量降低，由于IVC系统本身运行所需要的耗电量很低，因此IVC的应用能够节省运营成本[17]。空气进入IVC系统前，经过了三级空调净化后，又经过了IVC主机与各个笼盒的净化，裸鼠所呼吸到的空气处于一个相对洁净的状态。由于进入IVC系统之前，空气已经被过滤，这样的操作能够在一定程度长延长IVC系统的使用寿命与效率。这样，既能保证了裸鼠生长繁殖的微环境处于SPF状态，也能防止裸鼠之间相互传染疾病，同时对研究人员的身体健康起到了保护的作用。由于裸鼠没有毛发进行包被与保护，其适于裸体小鼠的室温为26～28 ℃（78～820 F），

其散失体温较有毛小鼠为快。处于连续空气层流中，它们的散热更快，需要大约28 ℃（800 F）的室温予以补偿。一般饲料室内温度控制在（25±1）℃也可以。如果裸鼠和有毛杂合子鼠同笼饲养时室温可略低一点。饲料在连续空气层流室中的裸鼠需要将层流室内温度提高到28 ℃。相对湿度应保持在40%～60%，此时，成年裸体小鼠皮肤水分散失最少。湿度过低，对新生裸鼠生存不利，这在空气层流环境中尤为重要。

IVC独立送风系统的良好运行，关键在于送、排风系统的设计与安装。以国外先进设备为基础，将动物福利考虑在内，IVC笼盒内的空气流向应该使得过滤净化后的空气均匀平稳的分布在内，构成正压风幕，避免过强气流的产生[18]。要防止笼盒内的裸鼠特别是新生的仔鼠，由于风速过大、通风过度而出现脱水的现象，与其他普通小鼠相比，没有毛发包裹的裸鼠更容易脱水致死。除了笼盒上部的气流，笼盒下部也应该有均匀稳定的气流通过，以使得垫料处于干燥的状态，将裸鼠代谢产生的异位一并排出。送、排风系统的设计需要适用于整体（小于

5 kPa）或分体式独立通风笼具的设计与制作[19]。

经过改良育种后的远交系无胸腺裸鼠，依据有无IVC分为研究组与对照组。对照组的分娩间隔（41.2±2.7）d与研究组（43.7±2.8）d比较，差异无统计学意义（P>0.05），而对照组平均每胎产仔数为（7.8±1.4）只，研究组为（7.9±2.8）只，两组比较差异无统计学意义（P>0.05），这说明在裸鼠繁育中应用IVC系统对其生育能力没有显著影响。新生的仔鼠出生8周即性成熟后，对照组的存活率为（76.9±3.4）%，显著低于研究组的（86.4±1.7）%（P<0.05）。

综上所述，在裸鼠繁育的过程中，应用IVC独立送风系统，对裸鼠的生育能力没有影响的同时还能够显著性的提升新生仔鼠的存活率，使扩群的速度与质量得到有效的保证，为下一步进行免疫学方面的研究或者是构建多种人恶性肿瘤的模型奠定了坚实的基础，在临床研究中具有较大的应用价值。

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（收稿日期：2018-06-06） （本文编辑：张爽）