不同浓度的完全弗氏佐剂影响大鼠疼痛行为的观察

贾欣 代洁琼 乔巧玉 赵欣 王志华 关晓雅 杜振莹 张宇

【摘要】 目的：观察脚掌注射不同浓度完全弗氏佐剂（complete Freunds adjuvant，CFA）产生的不同强度的伤害刺激对大鼠痛感受和痛情绪反应程度的影响。方法：福尔马林诱导的条件性位置回避（conditioned place avoidance，CPA）的行为测试近来被用于评估痛情绪反应。本实验采用另一种炎性致痛物质CFA在大鼠的脚掌皮下注射使之产生持续性炎性痛，诱导大鼠产生条件性位置回避（conditioned place avoidance，C-CPA）反应。根据在大鼠的脚掌皮下注射不同浓度的CFA将大鼠分为正常（Naive）组，生理盐水（NS）组，1/5 CFA组，1/3 CFA组，1/2 CFA组，之后分别检测各组大鼠的热缩足潜伏期（paw withdrawal latency，PWL）和C-CPA反应。结果：1/3 CFA组和1/2 CFA组匹配后热缩足潜伏期与匹配前比较，均明显减小，即痛阈下降，且两组匹配前与匹配后的差值与生理盐水组相比，差异均有统计学意义（P<0.05）；1/3 CFA组的下降值小于1/2 CFA组（P<0.05）；1/2 CFA组在匹配后痛侧停留的时间明显缩短，且回避分数与生理盐水组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：CFA所诱导的PWL反应和CPA反应的程度与CFA的注射浓度有关，从行为上证实大鼠痛情绪与痛感受的产生存在不同的机制。

【关键词】 完全弗氏佐剂； 条件性位置回避； 前扣带皮层； 痛情绪

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.29.001

慢性疼痛是一个世界性的医疗难题，它既是与大多数疾病相伴生的临床症状，同时本身也是一种疾病[1]。患者除了遭受疼痛造成的肉体伤害之外，其导致的心理、精神伤害和社会并发症也成了一个重大的负担[2-3]。国际疼痛协会对疼痛的最新定义为“疼痛是一种与组织损伤或潜在的组织损伤相关的感觉、情感、认知和社会维度的痛苦体验”[4]。这一定义将疼痛分为感觉、情感、认知和社会四个维度，其中痛感觉主要感受疼痛刺激的性质、位置、强度等，痛情绪则指伤害性刺激引起的焦虑、恐惧、厌恶等情绪反应[5]。痛情绪可分两个阶段：一是痛不愉快感（feeling of unpleasantness），它是对痛刺激的即时反应，又称原发性不愉快（primary unpleasantness）；二是继发性不愉快（secondary unpleasantness），是一种疼痛长期作用引起的情绪反应，它和接受疼痛刺激时所处的环境、疼痛对将来生活的影响、慢性疼痛引发的焦虑恐惧等密切相关，其涉及疼痛、认知、学习记忆等因素，需要大脑的高级中枢对这些信息进行整合[6]。与痛感受相比，介导痛情绪的神经传导通路及其产生的中枢机制大为不同。

研究表明躯体感觉皮质（S1和S2）和岛叶皮层被认为是编码痛感觉，包括性质（刺痛、灼热痛或心绞痛）、定位和强度[7-9]。前额区域和边缘系统（ACC、PFC、杏仁核、VTA和伏隔核）编码情绪和动机反应，并且和痛的情感和联系方面是有关联的[7，10-12]。和临床研究相反，在动物实验中很难去评价痛情绪。最近，各种各样的方法已经被应用评价持续性疼痛，在这些方法中，条件性位置回避（CPA）能够去评价大鼠的痛情绪[13]。在此基础上笔者实验室通过使用自制的CPA装置来检测大鼠的痛情绪，使用不同浓度的完全弗氏佐剂（CFA）作为炎性致痛物质来诱导大鼠产生慢痛反应，以此来观察脚掌注射不同浓度CFA产生的不同强度的伤害刺激对大鼠痛感受和痛情绪反应程度的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料

1.1.1 实验动物与分组 体重250～270 g的成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，购于北京海淀兴旺实验动物养殖场。大鼠分笼饲养于动物房，每笼4只，动物房室温维持在（22±1）℃，相对湿度40%～60%，大鼠能够自由进食、进水，昼夜循环光照，各12 h，大鼠領养回来适应1周后进行实验。根据大鼠左侧后脚掌注射不同浓度的CFA/NS，将大鼠分为5组：正常（Naive）组（7只），生理盐水（NS）组（6只），1/5 CFA组（6只），1/3 CFA组（7只），1/2 CFA组（7只）。

1.1.2 实验仪器与试剂 热板刺激仪（life science），条件性位置回避装置（自制），完全弗氏佐剂（CFA，sigma），啮齿类动物固定装置，NeuroMotive软件（USA），ANY-maze软件（USA）。

1.2 实验方法

1.2.1 建立大鼠持续性疼痛模型 配制不同浓度的CFA：CFA原液与0.9%氯化钠注射液分别按照0.25︰1、0.5︰1、1︰1的体积比混合成乳化状态。将大鼠固定于啮齿类动物固定装置上，抽取上述配好的混合液0.08 mL皮下注射于大鼠的左侧后脚掌。同时左侧后脚掌注射0.08 mL的0.9%氯化钠注射液作为对照。

1.2.2 痛行为和痛情绪的检测 （1）检测大鼠对热痛刺激的脚掌回缩潜伏期（PWL）。使用热板刺激仪进行测定，根据实验目的在脚掌注射CFA的前1 d和第2天条件性位置回避（CPA）行为测完后进行。先将大鼠放入热板刺激仪的有机玻璃罩内适应30 min，后取出，将热板升温至50 ℃，再次将大鼠放入有机玻璃罩内，从大鼠脚掌接触热板开始计时，大鼠出现舔后足或抬起即缩足反应时计时停止，此时间即为大鼠脚掌回缩潜伏期（paw withdraw latency，PWL）。每只大鼠测量3次，中间间隔15～20 min，之后取3次的平均值。（2）CPA反应的检测。通过条件性位置回避实验来反映大鼠的痛情绪反应。条件性位置回避的建立与检测：①自制条件性位置回避装置[14-15]，在进行条件性位置回避诱导时，随机设置其中一侧为非CFA匹配室即非痛环境，而另一侧则与致痛剂CFA注射进行耦合，称之为CFA匹配室，即痛环境。②CPA的检测：分三天进行，第一天，称重：选取符合体重的SD雄性大鼠（250～270 g），测CPA的基础值（baseline）：暗室适应30 min，后放入CPA装置自由活动

10 min，用軟件分析大鼠在两侧的停留时间。第二天：暗室适应30 min，后与非痛环境耦合30 min，左侧后脚掌皮下注射不同浓度的CFA/NS；CFA注射后休息120 min，之后置于暗室适应30 min，再进行痛环境耦合30 min。第三天：同第一天，暗室适应30 min，后放入CPA装置自由活动10 min，用软件分析大鼠在痛环境和非痛环境的停留时间。第三天痛侧停留的时间减去第一天痛侧停留时间即为回避分数，值越大代表回避程度越大，大鼠产生的痛情绪越明显。该方法的流程图见图1。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组内比较采用配对t检验，两组间比较采用t检验，符合正态分布的采用单因素方差分析，不符合正态分布的采用非参数检验，用GraphPad Prism 5.0软件绘制统计图。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 注射不同浓度的CFA后大鼠的热痛反应比较 Naive组、NS组和1/5CF A组第一天和第三天的脚掌回缩潜伏期比较，差异均无统计学意义（P>0.05），1/3 CFA组和1/2 CFA组第一天与第三天的脚掌回缩潜伏期比较，差异均有统计学意义（P<0.05），且第三天均显著减小，即热痛阈降低。1/3 CFA组和1/2 CFA组匹配前与匹配后的差值与NS组比较，差异均有统计学（P<0.05），且1/3 CFA组下降值明显小于1/2 CFA组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2、表1。

2.2 注射不同浓度的CFA后大鼠的CPA反应 大鼠左侧脚掌注射不同浓度的CFA使得大鼠在痛环境匹配前后痛侧环境的停留时间发生变化，Naive组、NS组、1/5 CFA组和1/3 CFA组匹配前在痛侧环境的停留时间和匹配后的停留时间比较，差异均无统计学意义（P>0.05），1/2 CFA组匹配前在痛侧环境的停留时间和匹配后的停留时间比较，差异有统计学意义（P<0.05），且匹配后在痛侧停留的时间明显缩短。1/2 CFA组的回避分数与NS组比较，差异有统计学意义（P<0.05），Naive组、NS组、1/5 CFA组和1/3 CFA组的回避分数比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2、图3。

3 讨论

慢性持续性疼痛作为一种对经济、社会产生重大影响的疾病，一直备受关注。长久以来慢性疼痛给患者带来的不仅是难以忍受的疼痛感受，而且还会产生更为严重的影响人们身心健康的负性情绪[16]。Harkines等[17]采用Eysenek and Eysenek问卷法对105个肌筋膜疼痛功能障碍（MPD）患者进行研究，分别观察两种相反的性格对痛感觉、痛情绪的影响，结果显示痛感觉和痛情绪可能存在分离、并行和序次的神经网络通路。上行传导束有两大系统其一是由脑干内测区上行的，经过旧脊丘束、脊髓中脑束、脊髓臂旁-杏仁束、脊髓臂旁-下丘脑束和脊髓下丘脑束，它们主要传递痛情感信息；另一个是位于脑干外侧区的，经过新脊丘束、脊颈束和脊髓背侧柱，主要传递痛的感觉分辨信息[18]。人们对痛感觉的研究在多个方面都取得了进展，但对痛情绪的研究却相对较慢。痛感觉诱发痛情绪有着比较明确的解剖结构基础和共同的物质基础[19]。在此基础上笔者所在实验室通过使用自制的CPA装置来检测大鼠的痛情绪，由于CPA能检测到与痛直接相关的情绪改变，并且没有进一步的伤害性刺激，因此越来越多的研究者认同这一行为学实验方案[15]。实验室前期证实了CFA与NS按照体积比为1︰1混合，皮下注射入大鼠左侧后脚掌后，可以诱导大鼠产生CPA反应，即使大鼠对痛环境产生厌恶，也使得大鼠的痛行为发生改变。因此本实验主要探讨脚掌注射不同浓度CFA产生的不同强度的伤害刺激对大鼠痛感受和痛情绪反应程度的影响。

在实验中，实验者通过给大鼠的左侧后脚掌注射不同浓度的CFA，检测大鼠的热缩足潜伏期及CPA反应。痛感觉检测的结果显示，1/3 CFA组、1/2 CFA组与其他组相比，热痛阈都明显下降，1/2 CFA组的下降值更明显，说明这两个浓度的CFA可以使大鼠对热刺激的敏感性增加；痛情绪结果发现高浓度组即1/2 CFA组与其他组相比，产生了CPA反应，即引起了大鼠的痛情绪反应。1/3 CFA组虽然产生了痛感觉，但其强度不足以引起痛情绪，但更高浓度CFA的作用能同时诱导痛感受和痛情绪的发生。说明痛感受的程度与伤害性刺激的程度相关，痛情绪的强弱也与伤害性刺激的程度有关，而同样的伤害性刺激，痛感受和痛情绪产生的阈值是不同的。这也从另一个角度说明，痛感受和痛情绪反应虽然都来源于同样的伤害性刺激，但它们却是通过不同的传导途径和机制产生的。

致谢：本实验在山西医科大学基础医学院生理学系完成，感谢各位老师和同学们在实验中对我的帮助。

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（收稿日期：2018-05-07） （本文编辑：张爽）