一次巧克力中沙门氏菌检验能力验证结果与分析

◎ 孙 葳，赵 虹，胡 嵩，王 超

（1.辽宁省检验检测认证中心，辽宁 沈阳 110032；2.辽宁省疾病预防控制中心，辽宁 沈阳 110005）

沙门氏菌病是由沙门菌属引起的疾病总称，在世界各地的细菌性食物中毒事件中，沙门氏菌食物中毒排在首位，临床表现多为败血症型和肠炎型，感染沙门氏菌的带菌者排泄物可污染食品，进而引起食物中毒、败血症、慢性肠炎等疾病[1]。能引起食物中毒的沙门氏菌血清型有很多，这次能力验证中检查出一株双相亚利桑那沙门氏菌，现结合多年检验工作经验分析此次能力验证工作，以期为未来检验工作提供一些参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

由国家食品药品监督管理总局组织，中国食品药品检定研究院发放的2018年NIFDC-PT-135巧克力中沙门氏菌检验能力验证考核样品3份，编号分别为CODE0461、CODE0593、CODE0615。

1.1.2 培养基及试剂

①BPW增菌液、BS平板、SC增菌液、三糖铁琼脂培养基（干粉）、沙门氏菌筛选显色平板、TTB增菌液、营养琼脂（干粉），购自北京陆桥技术有限责任公司。②氧化酶试剂、API 20E，购自法国梅里埃公司。③沙门氏菌诊断血清OMG、O60、He，n，x，购自泰国S& A reagentsLab Ltd, part。④沙门氏菌诊断血清Hr、Hz15、HMC，购自丹麦Statens Serum Institut。以上所用培养基及试剂均在保质期内，并已经质控合。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的处理

玻璃瓶的开启应在生物安全柜内进行。准备90 mL预热至45℃的灭菌BPW：首先取20 mL灭菌BPW加入检样瓶内，待巧克力样品融化后加入无菌均质袋内。取20 mL灭菌BPW清洗检样瓶，将洗液加入均质袋内，再取20 mL灭菌BPW重复清洗一次，最后向均质袋内加入30 mL灭菌BPW，充分均质混匀，制成1∶10稀释液。依此方法，分别对3件样品进行前处理。样品的融化参照GB/T 4789.24-2003《食品卫生微生物学检验糖果、糕点、蜜饯检验》进行。

1.2.2 增菌

①前增菌。将上述3份BPW增菌液，于（36±1）℃培养18 h。②选择性增菌。轻轻摇动培养后的3份前增菌样品溶液，分别移取1 mL，转种于10 mL TTB，于（42±1）℃培养24 h。同时，分别另取1 mL，转种于10 mL SC内，于（36±1）℃培养24 h。

1.2.3 分离

将上述选择性增菌液划线分离于沙门显色平板、BS平板。BS平板（36±1）℃培养48h，沙门显色平板（36±1）℃培养24 h，各平板上的菌落特征见表1。

表1 不同增菌液增菌后在沙门菌显色平板和BS平板上菌落形态表

按照GB 4789.4-2016对各平板菌落特征分析判断，将各可疑菌落编号为CODE0461-①～⑤、CODE0593-①～⑤、CODE0615-①～⑤，以上可疑菌继续如下试验。

1.2.4 初步鉴定

将可疑菌接种三糖铁琼脂，（36±1）℃培养24 h；同时接种营养琼脂平板做纯培养，（36±1）℃培养24 h后染色镜检并做氧化酶试验。可疑菌落三糖铁试验及染色镜检、氧化酶试验结果见表2。

表2 可疑菌落三糖铁试验及染色镜检、氧化酶试验结果表

1.2.5 生化鉴定

将 CODE0461-① ～ ⑤、CODE0593-① ～ ⑤、CODE0615-①～⑤、做API 20E生化鉴定，鉴定结果如下：

CODE0461-①③④⑤：

?

编码：0775000，鉴定为奇异变形菌，鉴定为：最好的鉴定%id=98.8

CODE0461-②：

ONPG ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA＋ ＋－－＋＋－－－－－＋＋＋＋＋＋＋＋＋

编码：3604773，鉴定为枸橼酸杆菌，鉴定为：最好的鉴定%id=99.9

CODE0593-①：

ONPG ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA－－－＋＋＋＋＋＋＋－＋－ － －－－－－－

编码：0775000，鉴定为奇异变形菌，鉴定为：最好的鉴定%id=98.8

CODE0593-②③④⑤：

ONPG ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA＋－＋＋＋ ---－-－＋＋－＋＋ -＋－＋

编码：5304552，鉴定为亚利桑那沙门氏菌，鉴定为：最好的鉴定 %id=83.6

CODE0615-①③④⑤：

ONPG ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA－－－＋＋＋＋＋＋＋－＋－－－－－－－－

编码：0775000，鉴定为奇异变形菌，鉴定为：最好的鉴定%id=98.8

CODE0615-②：

ONPG ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA＋－＋＋－－－－＋－－＋＋－＋＋－＋－＋

编码：5144552，鉴定为大肠杆菌，鉴定为：最好的检定%id=99.9

1.2.6 血清学鉴定

将生化鉴定为沙门氏菌属的营养琼脂培养物做沙门氏菌的O抗原与H抗原血清凝集试验，先做O多价，再做H多价凝集，用0.5%琼脂含量营养琼脂传代培养后再作H多价凝集试验及H因子血清试验，血清试验结果如下：CODE0593-②③④⑤：O 多价OMG：++++，O:60: ++++，H 多 价 HMC:++++，Hr: ++++，He,n,x：++++，He，n，z15：++++，HZ15:++++， 生理盐水对照：-。

鉴定为：双相亚利桑那沙门氏菌O:60：H1相r，H2相 e,n,x,z15。

1.2.7 实验过程质控

将阳性对照标准菌株鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028及阴性对照标准菌株大肠埃希氏菌ATCC 25922作为实验过程质控，阳性对照检出沙门氏菌，阴性对照未检出。

1.2.8 实验方法比对

在传统的方法的基础上，实验同时进行了全自动免疫荧光分析（VIDAS）、实时荧光定量PCR（BAX Q7）、全自动微生物鉴定系统（VITEK 2），以及MALDI-TOF-飞行质谱的方法比对，实验结果与传统方法一致。

2 结果与分析

2.1 结果

CODE0461用SC进行2次增菌后，在沙显平板上的无色小菌落鉴定为奇异变形杆菌、绿色中等大菌落鉴定为枸橼酸杆菌，在BS平板上黑色小菌落鉴定为奇异变形杆菌；用TTB进行2次增菌后，在沙显平板上的无色小菌落鉴定结果为奇异变形杆菌，BS平板上的黑色小菌落鉴定为奇异变形杆菌。

CODE0593用SC进行2次增菌后，在沙显平板上的无色小菌落鉴定为奇异变形杆菌，蓝绿色中等菌落鉴定为亚利桑那沙门氏菌，在BS平板上黑色有金属光泽菌落鉴定为亚利桑那沙门氏菌；用TTB进行2次增菌后，在沙显平板上的蓝绿色中等菌落鉴定结果为亚利桑那沙门氏菌，BS平板上的黑色有金属光泽菌落鉴定为亚利桑那沙门氏菌。

CODE0615用SC进行2次增菌后，在沙显平板上的无色小菌落鉴定为奇异变形杆菌、绿色中等大菌落鉴定为大肠杆菌，在BS平板上黑色小菌落鉴定为奇异变形杆菌；用TTB进行2次增菌后，在沙显平板上的无色小菌落鉴定结果为奇异变形杆菌，BS平板上的黑色小菌落鉴定为奇异变形杆菌。

2.2 分析与讨论

实验室在收到能力验证样品后，首先应检查样品包装是否完好，仔细阅读组织者提供的作业指导书，包括样本如何保存等信息。实验前，应严格按照作业指导书的要求制订检验流程，认真做好前期准备工作[2]。

2.2.1 样品的处理

样品的前处理一定要严格按照操作说明书进行，因巧克力融化比较困难，所以一定要提前将培养基预热，而且实际操作中，巧克力融化过程也较慢，一定要待巧克力完全融化后再将液体移入均质袋中，检样瓶也应反复慢慢冲洗，防止转移和溶解过程中液体溢出。还应注意的是检样瓶中的白色小球为干燥剂，如果干燥剂和巧克力粘连，应待巧克力融化后再将干燥剂取出。

2.2.2 增菌与分离

因考核样品中可能有干扰菌的存在，所以在2次增菌后，增菌液产生的分层现象和均匀浑浊现象都属正常情况，不可轻易做出判断。

平板划线分离过程非常重要[3]，要把目标菌尽量多地表达出来，应分离出单个纯菌落，并尽量多挑取可疑菌落，防止漏检。应以营养琼脂平板上的纯培养菌进行生化试验[4]。

在分离过程中，样品中某些干扰菌如奇异变形杆菌在BS培养基上与目标菌菌落形态相似，因此各种形态的菌落均应进行后续生化鉴定以防止漏检情况发生。常规判断沙门氏菌在显色培养基上为紫红色菌落[5]，此次能力验证检出沙门氏菌在显色培养基上为蓝绿色菌落，与大肠杆菌等干扰菌在沙门氏菌显色培养基上形态相似，固应引起重视。

2.2.3 血清型鉴定

本次验证实验中使用的是进口血清，在血清学鉴定之前，一定要用标准菌株做好质控，确定无质量问题后再使用。在血清凝集时，难点在于H抗原的第2相诱导[6]。本次实验第1项H抗原凝集后，进行了位相变异实验，烘干0.4%半固体琼脂平板表面水分，挑取H1相凝集血清1环，滴在半固体平板中间，待血清吸收后，在血清部位的中央点种待检菌株，培养后，在蔓延生长的菌苔边缘取菌进行H2相凝集试验[7-8]。

3 结论

在沙门氏菌检测中，为避免漏检现象的发生，应对亚利桑那沙门氏菌与常见沙门氏菌的不同特征引起重视。建议尽量多选取不同特征的菌落进行生化试验，同 时 结 合 如 BAX Q7、VITEK2、VIDAS、MALDITOF-飞行质谱等进行比对，绝不能就单一平板上的菌落形态作出判断。通过能力验证，可有效地检验本实验室的检测水平，同时在本次实验中，检验人员的检测水平和检测质量得到很大提高。