银杏叶提取物对对乙酰氨基酚诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用*

张全书, 王翔鹏, 谢燕妮, 武璐璐,2, 刘 红△

(1. 湖北民族学院医学院， 恩施 445000； 2. 风湿疾病发生与干预湖北省重点实验室， 湖北 恩施 445000)

对乙酰氨基酚(paracetamol ,APAP)是临床最常用的解热镇痛药，也是临床引起肝毒性的最常见的药物。过量摄入APAP所产生的肝脏毒性与肝细胞中线粒体的功能障碍、自由基代谢产物激增及氧化应激反应等联系密切[1,2]。APAP诱导的动物模型是临床中研究APAP肝损伤的重要方法。

银杏叶提取物(ginkgo biloba extract, GBE)是新型标准化中药制剂,其主要成分为总黄酮醇苷和萜类内酯，可直接清除自由基,减轻氧自由基和脂质过氧化损伤，能够通过Nrf2/ HO-1通路诱导药物代谢二相酶(HO-1、谷胱甘肽-S-转移酶、醌氧化还原酶等)抵抗药物的毒性[3,4,5]。研究发现GBE对由内毒素、酒精和缺血/再灌注导致的肝损伤均有保护作用[5-8]。许多天然提取物对APAP肝毒性具有对抗作用，但尚未报道GBE对APAP诱导的肝损伤具有保护作用。基于此，本实验拟探究GBE对APAP诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用及其机制，为开发APAP的临床解毒剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

银杏叶提取物片(德国威玛舒培博士药厂)；对乙酰氨基酚(APAP，美国Sigma公司)；谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase，AST)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素6(interleukin-6，IL-6)试剂盒(杭州联科生物技术有限公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒和ECL发光液(上海碧云天生物技术研究所)；转录NF-E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)、血红素氧合酶(heme oxygenase 1，HO-1)抗体及内参照β-actin蛋白抗体(美国Cell Signaling公司)。

1.2 仪器

精密电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限责任公司)；低温冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；全波长酶标仪(美国Thermo公司)；电泳及转印系统(北京六一生物科技有限公司)。

1.3 实验动物及取材

健康雄性C57/BL6小鼠30只，体重18～22 g，由北京维通利华生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2012-0001。常规条件饲养，适应性喂养7 d后，随机抽出6只为对照组，剩余的小鼠一次性腹腔注射300 mg/kg的APAP溶液进行造模，再随机将注射过小鼠分为4组，每组6只，分别为模型组、GBE低剂量组(50 mg/kg)、GBE中剂量组(100 mg/kg)和GBE高剂量组(200 mg/kg)。银杏叶提取物片研磨溶于生理盐水中，各治疗组小鼠以相应浓度药物溶液的0.2 ml灌胃对照组和模型组以0.2 ml生理盐水灌胃，每日两次，给药时间隔为12 h，连续给药2 d。末次给药后禁食不禁水，12 h后进行取材。小鼠摘眼球取血于1.5 ml的 EP管中，离心获取上层上清， -20℃保存，用于炎性因子检测。摘取整个肝脏，经0.9%的生理盐水漂洗后，用滤纸吸干多余液体，切取肝左叶用于病理组织学分析和氧化应激指标检测，其余肝脏装于EP管中，-80℃保存用于Western blot。

1.4 病理组织学

切取部分肝左叶于包埋盒，用4%多聚甲醛固定，乙醇脱水，石蜡包埋，切片机切片，HE染色，封片后光镜下观察病理组织学改变。

1.5 血清ALT、AST活性测定

根据试剂盒提供的操作说明测定血清ALT、AST活性。

1.6 血清炎性因子检测

TNF-α和IL-6均采用ELISA法，根据试剂盒提供的操作说明进行操作。操作完成后30 min内用酶标仪在450 nm、570 nm波长准确读取各孔的吸光值，再根据标准曲线计算出对应样品的浓度。

1.7 肝脏氧化应激指标检测

准确称取肝组织重量，按重量比1∶19加入生理盐水中制备成5%肝匀浆后待测。按照SOD、MPO、GSH、MDA试剂盒提供的操作说明进行操作，根据各自标准曲线计算出结果。

1.8 肝脏匀浆液Western blot检测Nrf2/HO-1水平

从-80℃冰箱取出肝组织，剪碎，置于裂解液收集目的总蛋白，采用BCA法测定蛋白含量，统一浓度，再配SDS-PAGE凝胶，点样15 μl，分离出组织蛋白样本转印至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别与Nrf2、HO-1和β-Actin抗体孵育(浓度1∶ 1 000)，4℃过夜后洗脱，再次以IgG抗体杂交(浓度1∶10 000)；最后采用 ECL 显色液进行化学发光显示电泳条带，用目的蛋白灰度值除以内参β-actin以校正误差，所得结果代表样品的目的蛋白相对含量。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 GBE对肝脏大体形态的影响

模型组与对照组相比，肝脏明显肿大，表面可见大量(点状)坏死灶；经过治疗后，GBE低、中剂量组与模型组相比，肝脏肿大有所改善，表面点状坏死灶减少；GBE高剂量组与模型组相比，肝脏肿大明显改善，表面点状坏死灶明显减少(图1，见彩图页Ⅵ)。

2.2 GBE对肝组织病理变化的影响

HE染色可见，对照组小鼠肝小叶结构及肝索排列正常，无肝细胞水肿、变性、坏死。模型组可见局部肝细胞坏死、肝小叶结构破坏、排列紊乱，肝细胞广泛性水肿，有大量炎细胞浸润。GBE低剂量组肝病变程度较模型组，有较轻的改善，局部仍可见大量炎细胞浸润。GBE中剂量组较模型组，肝小叶结构较完整，但肝小叶中心部仍可见较多肝细胞坏死和炎细胞浸润。GBE高剂量组肝组织结构较模型组，肝细胞排列整齐，形态完好，炎细胞浸润较少，有较大改善(图2，见彩图页Ⅵ)。

2.3 GBE对血清中ALT和AST活性的影响

模型组与对照组相比，血清中ALT和AST活性显著升高(P<0.01)；经过治疗后，GBE各剂量组与模型组比较血清中ALT活性显著降低(P<0.01)，GBE组与模型组相比血清中AST活性显著降低(P<0.01，表1)。

GroupALTASTControl27.3±5.131.5±12.4APAP177.1±10.9∗∗119.5±3.9∗∗GBE50122.2±4.2∗∗##67.3±8.2∗∗##GBE10086.6±7.3∗∗##58.5±9.4∗∗##GBE20058.8±4.9∗∗##46.6±4.4∗##

GBE： Ginkgo biloba extract； APAP： Paracetamol； ALT： Alanine aminotransferase; AST： Aspartate transaminase

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vsAPAP group

2.4 GBE对血清中TNF-α和IL-6水平的影响

模型组与对照组相比，TNF-α、IL-6的血清含量显著上调(P<0.01)；与模型组相比， GBE中、高剂量组的TNF-α的血清含量显著减少(P<0.01)；GBE低剂量组的IL-6血清含量减少(P<0.05)，GBE中、高剂量组均能显著减少IL-6的血清含量(P<0.01，表2)。

GroupTNF-αIL-6Control99.4±13.465.6±3.8APAP408.6±29.1∗∗206.6±14.3∗∗GBE50327.9±20.4∗∗160.2±16.9∗∗#GBE100210.4±25.5∗∗##105.1±20.7∗##GBE200170.2±28.6∗##80.4±10.9∗##

TNF-α： Tumor necrosis factor-α； IL-6： Interleukin-6

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group；#P<0.05，##P<0.01vsAPAP group

2.5 GBE对肝组织中SOD、MPO、MDA、GSH的影响

模型组与对照组相比，肝组织中SOD活性显著降低(P<0.01)，MPO活性显著升高(P<0.01)， GSH含量显著降低(P<0.01)，MDA含量显著增加(P<0.01)；经过治疗后， GBE中、高剂量组肝组织中SOD活性显著升高(P<0.01); GBE中、高剂量组肝组织中MPO活性显著降低(P<0.01)；GBE低剂量组肝组织中MDA含量降低(P<0.05)，GBE中、高剂量组肝组织中MDA含量显著减少(P<0.01)；GBE中、高剂量组肝组织中GSH含量显著增加(P<0.01，表3)。

GroupSOD(U/mg pro)MPO(U/g pro)MDA(mmol/mg pro)GSH (mg/g pro)Control119.1±15.10.29±0.034.69±0.794.31±0.77APAP47.7±3.5∗∗1.24±0.12∗∗9.30±2.29∗∗1.62±0.41∗∗GBE5068.9±8.1∗∗1.11±0.09∗∗7.65±0.81∗∗#2.28±0.37∗∗GBE10086.7±7.5∗∗##0.79±0.03∗∗##6.18±0.75∗##3.08±0.68∗#GBE20095.6±10.6##0.52±0.08∗∗##4.81±0.70##3.25±0.89##

SOD: Superoxide dismutase; MPO: Myeloperoxidase; GSH: Glutathione; MDA: Malondialdehyde

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group；#P<0.05，##P<0.01vsAPAP group

2.6 GBE对Nrf2/HO-1通路的影响

与对照组相比，模型组小鼠肝组织中Nrf2、HO-1表达水平显著抑制(P<0.01)。与模型组相比，GBE低、中剂量组Nrf2、HO-1表达水平略有增加，GBE高剂量组的Nrf2、HO-1表达水平提高(P<0.05，图3, 表4)。

Fig.3Effects of GBE on the pathway of Nrf2/HO-1

Nrf2： Nuclear factor erythroid 2-related factor 2； HO-1： Heme oxygenase 1

GroupNrf2/β-ActinHO-1/β-actinControl1.21±0.011.25±0.06APAP0.73±0.04∗∗0.71±0.05∗∗GBE500.79±0.01∗0.81±0.09∗∗GBE1000.97±0.040.94±0.03∗∗GBE2001.11±0.03#1.16±0.05∗#

Nrf2: Nuclear factor erythroid 2-related factor 2; HO-1: Heme oxygenase 1

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group；#P<0.05vsAPAP group

3 讨论

APAP是临床最常用的解热镇痛药，主要用来减轻感冒给人们造成的头痛发热。过量APAP经吸收后，通过细胞色素P450代谢产生毒性代谢物N-乙酰基-对-苯醌亚胺。虽然GSH可有效清除该毒性代谢物，但胞浆内和线粒体内GSH的大量消耗，会超过GSH的解毒能力，影响线粒体的正常工作，从而导致线粒体膜孔开放和线粒体膜电位崩溃(2～6h)，肝细胞受损[9]。炎症反应也会在过量使用APAP的短时间里激活，增加过氧化物的形成,加重肝损伤[10]。这些事件最终导致肝细胞肿胀坏死，引起急性肝损伤。

本研究结果表明，GBE对APAP所致急性肝损伤后的小鼠有一定的保护作用。实验结果表明，GBE高剂量组可明显减少肝脏表面(点状)坏死灶，减轻肝脏充血水肿。组织切片显示，GBE中、高剂量组肝组织形态改善明显，说明GBE能抑制损伤部位炎性细胞的趋化，减轻肝组织水肿。当肝细胞膜受到损害时，ALT、AST被释放进入血液，使血清中ALT和AST 的水平增加[11]。GBE能显著降低血清ALT、AST的水平，说明GBE能使细胞膜防御功能增强，避免肝细胞受损。当APAP的剂量过大时，超过GSH的解毒能力，会发生肝损伤，而GBE能够提高肝组织中GSH的含量，从而增强肝脏的解毒能力，使肝脏损伤减轻[9]。SOD能够有效清除氧自由基，GBE能够提高SOD的活性从而减轻肝细胞损伤。MDA是脂质过氧化物的最终产物，可以严重破坏细胞膜结构，导致细胞肿胀、坏死，是生物体内脂质过氧化程度的良好指示剂，且与APAP所致肝损伤关系密切[12]。经过GBE治疗后，肝组织中MDA含量显著降低，进一步证实GBE的抗氧化作用，能够抑制脂质过氧化反应，对APAP所致的肝损伤有保护作用。

TNF-α、IL-6等炎性因子在APAP诱导的肝损伤中有加剧肝损伤的作用。血清TNF-α、IL-6水平显著升高，会促进NO、组织胺、白三烯等的产生，造成肝细胞坏死，经过GBE治疗后，血清中TNF-α、IL-6的水平显著降低，说明GBE能够抑制炎性反应，阻止APAP诱导的肝损伤的加重[13]。MPO是一种重要的含铁溶酶体，是人体中最重要的氧化应激指标，是中性粒细胞中最重要的氧依赖性酶之一，释放到局部组织或血液，可产生活性氧和活性氮导致氧化应激和氧化性组织损伤[11,14]。GBE能够显著降低肝组织中MPO的活性，进一步证实GBE在APAP诱导的肝损伤中的抗氧化、抗炎作用。

Nrf2 /HO-1 通路在机体氧化损伤保护中有着重要作用，是机体最重要的抗氧化应激机制之一,对药物介导的肝损伤具有保护作用[15]。在正常情况下，Nrf2与其抑制蛋白 Keap1 结合存在于细胞质中，在氧化应激等刺激下，Nrf2与 Keap1解离并易位到细胞核，调控一系列抗氧化基因的转录，比如HO-1、谷胱甘肽-S-转移酶、SOD等，以促进氧化还原反应恢复平衡，减轻自由基损伤[16,17]。本研究表明，APAP诱导急性肝损伤后，经过治疗后，肝组织中Nrf2蛋白表达增加，同时HO-1蛋白表达增强，表明肝组织中Nrf2/HO-1途径激活，Nrf2发生核转位进入胞核，启动了下游抗氧化基因的表达，以对抗过量APAP产生的肝细胞毒性。

综上所述，GBE对APAP所致的小鼠肝损伤具有一定的保护作用，其作用机制可能是GBE能够激活Nrf2 /HO-1通路促进氧化还原反应恢复平衡，抑制大剂量的APAP引起的氧化应激反应，减轻炎性反应，调控SOD、MPO等酶的活性，抑制脂质过氧化反应，修复受损细胞膜，降低肝细胞膜通透性，减少转氨酶的释放，从而起到保护肝脏的作用。