新型轮状病毒反向遗传学系统的开发及应用

葛 雨，冉旭华，闻晓波

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

轮状病毒（rotavirus，RV）是呼肠孤病毒科轮状病毒属重要成员，是导致婴幼儿和幼龄动物腹泻的主要病原体之一。RV的基因组由11个独立片段的dsRNA组成，编码6种结构蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7）和5/6种非结构蛋白（NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5/NSP6）。人们对RV 11个基因片段功能、作用机制研究并不透彻，且不同毒株之间，重配、重排事件的不断发生，很难有目的地、精确定位地改造基因的精细结构以确定这些变化对表型性状的直接影响。由于缺乏完全基于质粒的反向遗传学系统，阻碍了对RV复制和发病机制的深入研究。

反向遗传系统是指直接从生物的遗传物质入手来阐述生物生命发生的本质现象[1]。可以设计个别病毒基因中的特定突变，产生感染性病毒颗粒并探索其表型。RNA病毒的反向遗传系统涉及在cDNA基础上操作其基因组，需要将cDNA转染后，拯救具有感染性的活的子代病毒（野生型或突变型）。在最初的研究中使用了辅助病毒的共感染或双重感染。但是，由于携带工程化基因组的病毒颗粒可能很难从辅助病毒中分离出来，因此最终目的是创建仅含质粒或仅含RNA的反向遗传学系统，无需辅助病毒，它可以将工程化突变的表型变化精确表现。1990年有人提出开发RV反向遗传系统，经过20多年的研究[2]，如今已成功建立了仅RV 11个片段质粒的反向遗传系统，现将最新研究进展及其应用作以综述。

1 轮状病毒反向遗传系统的研究进展

1.1 模板依赖性体外R V R N A复制系统建立1990年，首次确定RV SA11株全基因组核苷酸序列[3]后有研究人员提出克隆用于测序的cDNA，并希望从克隆的cDNA中获得具有感染性的病毒粒子，进行RV反向遗传系统的开发。1994年Chen D等[4]建立了“模板依赖性体外RV RNA复制系统”，该系统在RV正链模板RNA上启动并合成全长双链RNA。许多研究者推测RV反向遗传学系统将会很快成功。然而，接下来的数年世界各地的研究者们虽然进行了深入的尝试，却没有利用这个系统获得任何重组轮状病毒。

1.2 辅助病毒驱动的反向遗传学系统的建立2006年，Komoto等[5]根据轮状病毒在体内的复制周期，提出一个理论：“应当识别并复制源自cDNA（已感染野生型轮状病毒）的正链RNA，通过RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）产生dsRNA，获得来自cDNA具有感染性的轮状病毒。这为反向遗传系统的研究提供了一个理论基础。2010年Troupin等报道了基于重排基因片段的优先包装RV的反向遗传学方法，该方法是通过利用辅助病毒来分离单基因替换的重组RV。2013年Richards等[6]在此基础上使用独立的选择机制产生了含有NSP2基因片段的重组病毒。在辅助病毒驱动的反向遗传学系统中获得了重组的RV[7-8]。虽然这种反向遗传系统在技术上是有限的，只能拯救部分片段的感染性，拯救效率也并不高，且需要辅助病毒的参与，重组的病毒难以区分开辅助病毒和轮状病毒，且在之后试验研究中也并没有用此方法再次获得重组病毒。但在此项试验中改变了轮状病毒基因组，获得了含有由cDNA衍生的VP4[9]、NSP2[10-11]和NSP3[10]基因片段的重组RV。这一成果为RV的基因工程研究打开了大门。

1.3 辅助质粒驱动的反向遗传系统的建立2017年Yuta Kanai等[12]在前人研究基础上开发了完全基于质粒的RV反向遗传系统，针对已建立的呼肠弧病毒科病毒反向遗传学系统，做了2个重要的修改，加入病毒融合的相关小跨膜蛋白（FAST）和减毒痘病毒（VV）加帽酶（D1R和D12L[13-15]）。FAST是唯一已知的未包膜病毒融合体[16]，可在体内促进病毒复制[17]。另外，由于RV mRNA 3'末端不是聚腺苷酸化的，将VV加帽酶用于重组的RV[18-20]中，T7pol转录物被VV加帽酶有效地封闭在细胞质中，从而提高翻译效率。Kanai等将RV的11个基因区段，以及编码FAST和VV加帽酶D1R和D12L的14个质粒共转染细胞，获得了重组病毒。在试验中为了排除与亲代病毒污染的可能性，在NSP1-NSP4基因区段设计了独特的酶切位点（作为遗传标记），排除了亲代病毒可能性。对RTPCR产物的直接测序，证实rSA11是来自cDNA的重组病毒，且其电泳型与天然SA11的电泳型无差别。病毒的复制动力学和峰值滴度测试结果也表明天然和重组病毒具有类似的复制特征[12]。同时Kanai等利用新开发的反向遗传学系统获得的重配病毒rSA11/KU VP6，和天然SA11的病毒表现出相似的复制动力学。获得的重配病毒是未曾报道过的，是从此次反向遗传系统中获得的独特遗传组合[12]。

1.4 无需辅助质粒的 R V的反向遗传系统建立2017年Komoto等[21]开发的完全基于质粒的RV反向遗传学系统已经取得了巨大的进步，但后续的研究发现VV加帽酶（D1R和D12L[13-15]）两种表达的质粒共转染对于获得重组病毒不是必需的，因此2018年Komoto等[22]将此方法进行了优化。在共转染时将其中一个片段的质粒相对其他质粒的3倍进行转染进行对比，发现分别在NSP2和NSP5的转染量增加时，病毒滴度增加。基于这个发现又将NSP2质粒和NSP5质粒转染量进行倍数增加对比，发现在NSP2质粒转染量增加3倍和NSP5质粒转染量增加5倍时重组病毒的拯救效率较好，成功建立了不需要辅助质粒的RV的反向遗传系统。该系统仅用RV的11个基因片段的质粒共转染BHK-T7细胞，获得源自cDNA的重组RV。虽然NSP2质粒和NSP5质粒转染量增加提高了病毒拯救效率，但其机制仍不清楚，需要进一步的研究。

2 RV反向遗传系统的应用

2.1 R V反向遗传系统在 R V致病机制研究中的应用

2.1.1 研究RV NSP1 C端区域功能在RV中NSP1可以通过促进IFN调节因子3（IRF3）的降解来拮抗干扰素（IFN）信号[23]，可利用反向遗传传系统分析C-末端截短的NSP1突变病毒在先天性免疫应答中的作用。2017年Kanai等利用基于14质粒的反向遗传系统，分别构建重组NSP1（rSA11）的RV和C-末端截短的NSP1突变体（rSA11-dC103），证明了NSP1的C-末端区域是其通过拮抗IRF3来抑制IFN信号传导所必须的[23-25]。

2.1.2 研究RV NSP6在病毒复制中的作用RV非结构蛋白NSP6存在于绝大多数轮状病毒毒株中，因此一些研究人员认为NSP6蛋白有利于增加病毒的复制。然而，在病毒复制周期中没有直接的证据能表明其功能及其必要性。2017年Komoto等[21]利用基于14质粒的RV反向遗传学系统获得重组的RV（rSA11）和NSP6缺陷型重组病毒，以研究NSP6在病毒复制周期中的功能。通过病毒生长曲线发现RV NSP6缺陷型病毒复制周期比rSA11慢，但是最终可以达到一个相近的病毒滴度。噬斑形成结果表明NSP6缺陷型病毒形成的斑块较小。证实了虽然NSP6蛋白可以有效地促进病毒生长，但NSP6蛋白对细胞培养中的病毒复制不是必需的。

2.2 用于外源基因的表达

2.2.1 辅助质粒驱动的反向遗传系统在外源片段表达中的应用2001年Patton等研究发现，NSP1基因片段对病毒复制没有显著影响。在此基础上，2017年Yuta Kanai等[12]在基于14质粒的反向遗传系统中，利用分裂绿色荧光蛋白系统GFP（48 bp）标记NSP1，用以确定是否能够利用反向遗传系统拯救表达了外源小片段的RV。GFP包括GFP1-10检测器片段和GFP11标签片段通过自动组装能力来恢复完全荧光信号[26]。在重组NSP1 ORF的C-末端引入GFP11片段结果表明在细胞中表现出与重组病毒类似的复制动力学；观察GFP信号，GFP1-10与NSP1-GFP11仍有高效互补产生特定的GFP信号的功能[12]。rNSP1-GFP11蛋白分散在感染细胞的核周区域，与天然NSP1的分布相同[12]，证明NSP1基因片段对病毒复制没有显著影响，与前人研究一致[27-29]。GFP的成功表达，说明小片段的插入对重组病毒并没有影响，可将其应用于深入探讨RV结构特征的研究。

在进行小片段插入成功后，又进行了较大片段的插入尝试，在重组RV NSP1片段上插入NanoLuc萤光素酶（NLuc）（516 bp），成功拯救了表达NLuc的重组病毒（rSA11-NLuc）。试验中发现，rSA11-NLuc可在细胞中连续传5代保持不变，这种遗传稳定性可应用于RV感染时体内的追踪。Smee等[30]还用已知的RV抑制剂利巴韦林对rSA11-NLuc进行抗病毒筛选。在有效剂量内细胞无病理变化，在小剂量使用时，发现利巴韦林对rSA11-NLuc有剂量依赖性抑制，该研究表明rSA11-NLuc可用于新型抗病毒药物的筛选[12]。

2.2.2 无需辅助质粒的RV反向遗传系统在外源片段表达中的应用2018年Komoto等[22]在基于无需辅助质粒的反向遗传系统上，进行外源片段的插入，利用该系统获得重组的SA11（rSA11），将来自猪瘟病毒具有自我切割功能的2A肽序列（帮助病毒翻译、复制）和NanoLuc萤光素酶（NLuc）连接获得2A-NLuc，替换NSP1 ORF的N-末端获得rSA11-2A-NLuc重组RV病毒，并确定了2A-NLuc替换NSP1 ORF的N-末端不会阻断病毒的复制但复制效率略低，噬斑尺寸较小；同时rSA11-NLuc和rSA11在细胞中连续10传代，通过PAGE和荧光素酶分析，确定了rSA11-NLuc对NLuc表达的遗传稳定性是保持不变的。rSA11-2A-NLuc的成功拯救，证明了无需辅助质粒的反向遗传系统也可应用于外源片段的表达。基于这一发现，Komoto等尝试在NSP1插入更长的外源基因片段（EGFP和mCherry），其重组NSP1片段的大小分别为1 994 bp和1 982 bp，在感染细胞中连续传代10次仍能检测到，再次证实其稳定的遗传性。这为RV分子生物学的研究、开发新疫苗、构建载体作了重要的补充。

3 展望

RV反向遗传学系统，自1994年有人提出开发起，经过数十年的研究，在2018年终于成功建立一种无需辅助病毒、无需辅助质粒且高效、简化RV反向遗传系统，在新的抗RV病毒药物的筛选、新型活疫苗的开发等具有巨大的应用价值；并且可以解决RV的基本分子生物学问题，如“定做”的遗传变化引起的表型变化、宿主范围限制、病毒致弱等方面都具有重要意义。该新型RV的反向遗传操作系统是研究RV的细胞侵入、病毒基因和蛋白合成、病毒释放以及致病机制的强有力“武器”，将极大地加快RV相关领域的研究步伐。但是，利用该项反向遗传系统的工作机制仍不清楚，例如双链RNA的合成，是否与蓝舌病的反向遗传系统具有相似之处；对于来自不同群的RV基因片段的反向遗传拯救工作仍未成功；另外，提高NSP2和NSP5质粒转染量为什么就不需要辅助质粒参与就可以完成RV拯救，这一机制尚不清楚，仍需要进一步的研究。