PCR技术在食品微生物检测中的运用

◎ 陈永燕，李虹红

（梅州市食品药品监督检验所，广东 梅州 514000）

民以食为天，现在人们不再单单只要求能够吃饱，还要吃得安全、吃得放心。食品安全是关系民生的重大问题，但近些年的食品安全问题层出不穷，前些年的毒奶粉事件之后又是连续的毒馒头、地沟油和水果农药含量超标等食品安全问题。这迫切要求提高食品的检测技术，以保证人们的饮食安全。食品中微生物含量的检测是食品检测中非常重要的一环，很多食物无法食用就是因为微生物的含量超标，加速了食物的腐败。近些年来，PCR检测技术逐渐出现在人们的视线中，该技术因其快速、简便、准确的优点受到业内专业人士的青睐。

1 PCR技术介绍

1.1 PCR技术原理

PCR技术早在1971年的时候由Khorana提出了设想，在当时这种技术被认为是不可能的，后来经过十几年的发展，到了1985年时被美国科学家Kary Mullis正式研究出来。PCR技术（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）被研究出之后立即就成为基因工程中的重要技术手段，为食品的微生物检测领域带来了新的快捷的方法。目前，我国的食品检测科学工作者正致力于将PCR技术应用在啤酒等日常食物的微生物含量的检测中，不但是我国，许多发达国家如美国、加拿大、日本等也在进行这项工作。利用PCR技术进行检测的基本原理是在PCR体系下将食物加温，如果食物中存在微生物，则它们的核酸序列由于外界的高温会发生变性。一般PCR体系刚开始时温度可以达到94 ℃（温度不可以过高，否则微生物会被直接杀死），微生物的DNA在这个温度下会裂解成单链。然后降温，将PCR体系中的温度直接下调到55 ℃，再将体系温度升到72 ℃，引物会与模板DNA结合，在DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链，之后就是重复以上步骤。最后只要检测产物中是否含有特异性的DNA片段即可。特异性引物只可以生长在微生物上，而且比微生物要容易检测。这样的检测技术不但结果更加准确，还可以对目的片段进行测序，确定是何种微生物[1]。

1.2 PCR技术需要使用的原料

要想利用PCR技术，需要多种原料相互作用。由于PCR技术的进步，目前使用的原料较之以前又有增加。①特异性的引物，这种引物必须事先准备好，这些引物只能与微生物发生关系，不能够随意结合到食物的其他成分上，且不可以过长，最好是15～20个碱基长度。引物之间不可以发生互补反应，引物的设计和合成直接决定了PCR技术能否成功，因此必须要严格对待。②DNA聚合酶，主要作用是促使引物与微生物的DNA结合。引物是一小段特定的DNA，但是要使其自动与微生物DNA结合存在一定的困难，而DNA聚合酶具有一定的催化功能，可促使这一目标达成。现阶段使用的主要是Tap DNA酶，这种聚合酶具有良好的耐高温性，即便是在90 ℃下也不会失活。③缓冲液。一般而言，缓冲液与DNA聚合酶是配套使用的，因为聚合酶的活性比较差，容易受到外界物质的影响，所以需要一定的保护。在缓冲液的作用下，引物与微生物之间更容易发生联系。④Zn2+离子，它可为聚合酶提供足够的活力，保证其发挥良好的催化作用。Zn2+离子浓度直接会影响PCR产物的数量，因此在进行检测时对于Zn2+的浓度一定要掌握好，否则测量出的结果将会不准确[2]。

2 PCR技术的实际应用

2.1 对食品中致病菌的检测

食品中的致病菌对于人体的健康有很大的危害，且致病菌的种类很多，如立克次氏体、衣原体、支原体、病毒、真菌等，为了保证食物不会对人体产生危害，这些致病菌的含量必须控制在合理范围内。在检测时，首先需要将这些致病菌的样本提取出来，通过高速离心的方式将致病菌分离出来，在高温条件下将它们裂解得到核酸。之后要研究致病菌DNA的排列顺序，尽可能选择出致病菌群中有代表性的DNA片段，在选择靶DNA后根据其序列研制能与之结合的特异性引物，以上工作做好之后才可以对食物中的致病菌含量进行检测，只要检测到含有引物的DNA中具有之前选定好的靶DNA片段即表明这个是致病菌细胞。目前，测定食物中的沙门氏菌、变形弧菌、大肠杆菌等致病菌都采用这种方式，而且经过多次验证，PCR技术比传统检测方式更加迅速、精确。

2.2 对食品中乳酸菌的检测

乳酸菌是一类可以产生乳酸的细菌的总称，目前发现的大部分乳酸菌都是有益菌，特别是在促进人类健康生长、帮助肠胃消化、改善肠道功能、降低血清内的胆固醇含量、提高机体的免疫力这些方面有很大的帮助，但其中一部分乳酸菌对人体有害，所以人们在购买食物时对于乳酸菌的含量格外看重，这就要求对于乳酸菌含量的测量也必须更加准确。对于乳酸菌的检测，我国开始研究的时间比较早，科研人员发现乳酸菌的DNA序列在1414～1432位置的21个碱基排列非常有代表性，而且并不是只有一种乳酸菌拥有这种排列，双歧杆菌等前前后后共有32种乳酸菌被发现具有此代表性的碱基排列，因此目前对乳酸菌含量的检测主要是针对这21个碱基序列。要想得到这个序列，只需要利用SDS方法将乳酸菌细胞裂解，再利用蛋白酶将细胞中的蛋白质去掉即可得到完整的乳酸菌核酸，再将自己所需的基因片段提取出来研究相应的引物，因为这个片段是乳酸菌特有的，所以不用担心引物会与其他物质结合，从而达到检测乳酸菌含量的目的。

2.3 对食品中啤酒腐败菌的检测

啤酒是人们生活中常见的食品，而且目前我国的啤酒产量很大，啤酒的种类也很多。众所周知，啤酒是通过发酵得到的，其中扮演着重要角色的就是乳酸杆菌。啤酒的主要原料啤酒花中含有一定量的异A酸，这种酸有一定的抑菌作用，但是乳酸杆菌特别是乳杆菌对这种酸的存在有很大的影响，有日本学者认为啤酒的腐败与乳杆菌有直接关系。经过研究发现，软杆菌上能够抑制异A酸生长的是一种horA基因，而能够引起啤酒变质的乳杆菌几乎都含有这种基因，从而证明了horA基因对啤酒花存在一定的抗性。在得到这个结论之后，日本的科研人员立刻根据horA的基因顺序合成了特异性引物，再加上DNA聚合酶和乳杆菌的DNA提取液，利用电泳对最后的产物进行检测，得到的结论与之前他们调配的浓度十分接近，由此啤酒中的腐败菌检测手段被研发出来，这种方法检测时间只需要6 h，而传统的平板培养方法至少需要3 d，在效率上有了很大的提高。

3 结语

食品的检测在朝着高效、快捷、方便的方向发展，PCR技术无疑是满足以上需求的。但实际上，PCR技术还存在着一定的缺陷，如对于细胞内存在能够破坏聚合酶的真细菌就无法使用该技术。但是，相信在不久的将来，PCR技术一定可以完善自身，不再仅仅局限于食物的微生物检测，人体免疫学、分子生物学都有可能使用到PCR技术。

[1]李 勤，盛占武，孙志高，等.实时荧光定量PCR技术在食品微生物检测和研究中的应用[J].四川食品与发酵，2010，42（5）：9-12.

[2]徐 岩，张丽萍，顾国贤.聚合酶链式反应（PCR）技术鉴定啤酒腐败菌的最新进展[J].酿酒科技，2000，27（5）：71-74.