SNARE及其相关蛋白与生育能力相关性的探讨

(天津爱维医院生殖中心，天津 300171)

可溶性NSF附着蛋白受体(Soluble NSF Attachment Protein Receptor，SNARE)蛋白通过介导囊泡的膜融合来调节细胞内的物质运输和调节神经递质的释放。此外，多项研究表明SNARE及其相关蛋白与卵泡发育排卵、卵母细胞的减数分裂、受精和男性生殖器的发育存在一定的关联。

一些大分子物质或是不能穿透细胞膜或是细胞器膜的颗粒性物质，需要借助囊泡转运(Vesicle trafficking)的方式来实现物质进出细胞的转运以及物质在细胞内各个细胞器之间的转运。在囊泡转运过程物质被膜包裹形成囊泡、囊泡与质膜融合后将物质释放到细胞外或目标细胞器腔内。如胰岛素在胰岛β细胞内高尔基体上合成分泌后,它被包裹形成囊泡，囊泡与细胞膜融合后将胰岛素分泌到细胞外(血液中)[1]。而在囊泡膜融合过程中可溶性NSF附着蛋白受体(Soluble NSF Attachment Protein Receptor，SNARE)及其相关蛋白起着重要作用。

1 SNARE及其相关蛋白的概述

1.1SNARE蛋白的构成：可溶性NSF附着蛋白受体(Soluble NSF Attachment Protein Receptor，SNARE)蛋白因为作为N-乙基马来酰胺-敏感因子(N-ethyl-maleimide-sensitive factor,NSF)和可溶性NSF附着蛋白(soluble NSF attachment proteins,SNAP)的膜受体而被命名。SNARE蛋白是一个庞大的蛋白超家族，在哺乳动物的细胞上其拥有60个成员[2]。Synaptobrevin/VAMP,syntaxin及SNAP-25以1：1：1的比例聚合成稳定的三聚体结构,即SNAREs核心复合体。其中Synaptobrevin/VAMP为位于囊泡膜上的SNARE蛋白(vesicle membrane SNAREs，v-SNAREs)，syntaxin及SNAP-25则是停靠在靶细胞膜或是靶细胞器膜上的SNARE蛋白(target membrane SNAREs，t-SNAREs)。v-SNAREs与t-SNAREs结合形成SNARE核心复合体，从而启动了囊泡膜融合过程[3]。

1.2SNARE主要相关蛋白及功能：现笔者简要介绍与膜融合过程关系密切的三类SNARE相关蛋白。Munc-18蛋白在脊椎动物体内被发现，有研究表明Munc-18 与syntaxin 结合可调节SNARE 核心复合体的形成。在最新的研究中发现，Munc-18在二型糖尿病大鼠胰岛内的过量表达可以促进Munc18b/Syntaxin-3/VAMP8/SNAP-25复合体的组装，从而促进膜融合增强胰岛素的释放，改善由于对葡萄糖刺激不敏感所导致的胰岛素分泌不足[4]。但也有其他研究表明Munc-18与syntaxin 结合会抑制后者与SNAP-25或是Synaptobrevin的结合从而阻碍SNARE 核心复合体的形成[5]。

在膜融合囊泡内物质释放之后,NSF和α-SNAP蛋白协助SNARE 核心复合体解聚，从而实现SNARE蛋白的循环再利用。其中NSF具有ATP水解酶活性，它与SNARE 核心复合体结合后为SNARE 核心复合体的解聚提供能量。而NSF与SNARE的结合必须借助α-SNAP才能实现[6]。

2 SNARE及其相关蛋白对生育能力的影响

2.1对卵泡发育及排卵的影响：α-SNAP协助NSP实现SNARE 核心复合体解聚和循环再利用，因此α-SNAP对维持SNARE蛋白的功能以保证囊泡膜融合能持续进行起到重要作用。有研究者检测出生天数不同的小鼠卵巢中α-SNAP的表达量，结果显示α-SNAP的表达量在出生后30 d小鼠卵巢中开始明显升高，并且在出生后60 d小鼠卵巢中其表达量上升至顶峰。考虑在出生后30 d或60 d的小鼠的卵巢内处于发育阶段的窦卵泡数目大量增加，因此可以推测α-SNAP的表达量与发育的窦卵泡和成熟卵泡有关。此外，研究者对比了α-SNAP基因突变小鼠和正常野生小鼠的各项结果，发现在给予这两种小鼠PMSG/HCG刺激后，这两种小鼠卵巢内的α-SNAP的表达量均较刺激前有所增加，α-SNAP基因突变小鼠卵巢中α-SNAP的表达量要明显低于正常野生小鼠，并且α-SNAP基因突变小鼠卵巢中窦卵泡占总卵泡的比例也低于正常野生小鼠。在给予PMSG/HCG刺激后，α-SNAP基因突变小鼠卵巢中排卵后的黄体数目明显低于正常野生小鼠，而且取卵所得到的MII期成熟卵子的数目也少于正常野生小鼠[7]。以上的研究结果提示了α-SNAP与卵泡发育、成熟及排卵有关。

SNAP-25、Synaptobrevin和syntaxin 是构成SNARE核心复合体的蛋白，它们的表达量直接影响SNARE核心复合体介导的膜融合。有研究显示在注射了孕马血清促性腺激素(PMSG)后，在FSH的刺激下小鼠卵巢内SNAP-25和synaptotagmin VII的表达量明显增加，并且将FSH受体的 siRNA导入窦前卵泡的颗粒细胞后解除了FSH刺激所导致的SNAP-25和synaptotagmin VII的表达量的增加。表明SNAP-25和synaptotagmin VII的表达受FSH及FSH受体的调节[8]。同时其他文献报道在注射HCG后8 h，大鼠卵巢颗粒细胞中SNAP-25的表达量明显增加，并且孕酮受体(Progesterone receptor，PGR)基因表达小鼠(排卵障碍小鼠模型)在注射HCG后8 h其卵巢颗粒细胞上SNAP-25的表达的增加量要明显低于正常野生小鼠，这表明SNAP-25的表达量受LH调节[9]。但也有文献报道调节SNAP-25在颗粒细胞上表达量的是FSH而不是LH[10]。有研究者发现雌激素(E2)和睾酮(T)降低了人呼吸道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMCS) 上SNAP-25的表达[11]。此外，有研究表明伴有胰岛素抵抗的多囊卵巢综合征患者子宫内膜上Munc18c的表达量高于正常子宫内膜，而其Syntaxin-4的表达量低于正常子宫内膜。同时体外实验添加胰岛素和睾酮显著降低了人子宫内膜间质细胞上Munc18c的表达，但未影响其Syntaxin-4的表达量[12]。

综上所述，可以推断SNARE及其相关蛋白与卵泡发育、成熟及排卵有关。关于SNARE及其相关蛋白调节卵泡发育的作用机制尚未明确。但是之前有研究指出颗粒细胞或卵母细胞是以胞吐的形式分泌抗苗勒管激素(AMH)、骨形态发生蛋白15(BMP15)及生长分化因子9(GDF9)[13]等卵泡发育调节因子。因此笔者推测SNARE及其相关蛋白通过影响囊泡的膜融合过程来影响这些卵泡生长调节因子的胞吐式分泌释放，从而调节卵泡生长过程。同时笔者还猜测SNARE及其相关蛋白不仅影响这些卵泡生长调节因子从颗粒细胞或是卵母细胞上的胞吐式分泌，还有可能影响这些调节因子作用于下丘脑、垂体及卵巢细胞时的膜融合胞吞过程，从而影响它们对下丘脑、垂体及卵巢的反馈调节作用。当然，这些猜想和推断需要进一步的研究来验证。

2.2对卵母细胞的减数分裂的影响：由于持续高水平的环磷酸腺苷(Cyclic Adenosine monophosphate，cAMP)在维持减数分裂抑制中起到重要作用，而持续性活化的G蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptor，GPCR)对于维持高水平的cAMP起重要作用，同时活化的GPCR是通过参与囊泡膜融合的过程实现信号转导。因此有研究者通过诱导SNAP-25基因突变的蟾蜍卵母细胞来探讨囊泡膜融合与减数分裂抑制之间的关系。结果表明阻断囊泡膜融合导致了丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C(cell division cyclin 25 homolog C，Cdc25C)信号的骤减，从而激活了促成熟因子 (maturation promoting factor，MPF)，诱发生殖泡裂解、促使卵母细胞成熟并停留于第二次减数分裂中期(MII期)。也就是说SNAP-25基因的突变、囊泡膜融合的障碍会破坏减数分裂的抑制而诱发卵母细胞的减数分裂再启动和成熟化[14]。此外，有研究表明syntaxin 4表达于第二次减数分裂中期(MII期)的卵母细胞上[15]。

2.3对受精过程和男性生殖器发育的影响：顶体为覆盖成熟精子头部表面2/3的囊泡结构，在顶体内部存在大量的顶体酶。精子头部与成熟卵子的透明带接触后诱发顶体反应，导致顶体内的顶体酶以泡吐的方式释放出来。普遍认为顶体反应与SNARE蛋白介导的膜融合过程有关联。当精子头部与透明带接触后，随着Ca2+的内流，精子头部质膜形态发生改变以暴露顶体外膜，然后顶体外膜与卵子质膜在SNARE蛋白介导下发生膜融合，膜融合之后，在顶体外膜上出现许多小孔，顶体酶经这些小孔释放出来消化局部的透明带，同时顶体帽逐渐从精子头部脱落下来，之后穿过透明带的精子头部与卵子质膜上的受体结合从而启动精子头部质膜与卵子质膜的融合[16]。有研究发现在精子的中段、尾部和精子头部的细胞内部构造中不存在syntaxin1和syntaxin2，但是在精子头部的顶体表面有syntaxin的存在，但是在精子头部的赤道板和顶体后区域上没有syntaxin的存在，同时VAMP1和VAMP2也存在着类似的分布[17]。此外，有研究表明α-SNAP缺陷的雄性小鼠的精子存在顶体反应障碍阻碍受精[18]。由此证实SNARE蛋白与受精过程中的顶体反应存在着一定的关联。

为了研究SNARE蛋白对男性生育能力的影响，研究者将含有人类VAMP7基因的染色体显微注射入小鼠的受精卵内，以得到表达人类VAMP7基因的雄性小鼠模型。结果表明VAMP7基因表达的增加会导致雄性小鼠双侧睾丸下降障碍导致隐睾，同时还可以导致雄鼠外生殖器的畸形。并且经实验证实这是由于VAMP7增强了雌激素受体在雄鼠泌尿生殖系统的效应，因此导致生殖器男性化发育障碍，造成先天性泌尿生殖系统缺陷[19]。

3 结语

SNARE及其相关蛋白通过介导囊泡融合过程从而调节神经递质的释放和细胞内的物质转运。已经有研究表明SNARE及其相关蛋白与儿童多动症[20]及对葡萄糖刺激不敏感所致的胰岛素分泌障碍型二型糖尿病有关联[4，21]。同时，对SNARE及其相关蛋白与女性和男性生育能力相关性的研究表明，女性的卵泡发育、成熟及排卵，还有男性精子和生殖器的功能均与SNARE及其相关蛋白有着密切的关联。因此，进一步阐明SNARE及其相关蛋白对生育能力调节的具体作用机制，对实现通过调节SNARE及其相关蛋白的效应来改善各种生育障碍性疾病具有重要意义。