食品微生物检测中PCR技术的应用研究

◎ 王晓虹，程帮全

（浙江优科检测技术有限公司，浙江 杭州 311106）

PCR技术即聚合酶链式反应，在食品微生物检测中的利用价值极高。近年来，该技术的使用范围逐渐扩大，并成为食品微生物检测的重要手段。能够有效提升微生物检测的质量与效率，为人们创造安全的食品使用环境。

1 PCR技术综述

1971年，美国Khorana便已经提出关于PCR技术的设想，但被认为是妄想。经过众多年的努力与研究，1985年该技术正式登上历史舞台，被后人所熟知。该技术出现后便被利用在基因工程中，实现了食物微生物检测的新升级。当前，世界各国均努力将PCR技术应用在食品微生物检测中。通常，PRC技术的检验流程为：温度升至94 ℃变性，DNA双链裂解成单链。再降低温度，一般下调至55 ℃退火，再升到72 ℃延伸，再反复重复有关步骤，实现对微生物的检测。利用该技术可大大提升准确度，并实现对目的片段进行测序，确定微生物种类的基本目的[1]。

2 PCR技术在食品微生物检测中的利用价值

PCR技术具有较大的应用价值。①操作较为简单，且对食品质量不会产生影响，大大提升微生物检测的效率。同时，其所使用的设备较少，在简单的环境下便能够完成对微生物的检测工作。②PCR技术对食品微生物检测的准确率较高，在短时间内便能够确定食品中是否含有微生物，且该技术自动化程度较高，较比传统检测方法而言更加精准、高效。③该技术的发展空间较大，研究人员在常规PCR技术基础上，能够设计出更多的检测方法，实现高效、快捷、准确的食品微生物检测方法，提升PCR技术的检测能力，确保食品安全性，规避风险。

3 PCR技术

3.1 技术原理

PCR技术的使用实现了快速检测，在低成本基础上，提升灵敏性，实现快捷操作。该技术原理为：DNA的半保留复制是生物进化与传代的重要途径。双链DNA在DNA聚合酶的作用下，可变性解旋成单链，并根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。因此，通过温度的变化，控制DNA变性与复性，加入设计引物等，便可完成特定基因的体外复制。

3.2 PCR所需要的材料

该技术在使用过程中需要多种原料，随着技术的进步，在原有基础上原料又有所增加。①特异性的引物，该引物需要工作人员提前准备，并只能特异性扩增目标微生物的DNA片段。同时，该引物不应过长，通常在15～20个碱基。特异性引物不可产生互补反应。②DNA聚合酶。引物是一小段特定的DNA，与微生物DNA结合相对较为困难。因此，需要DNA聚合酶起到促进作用，对引物与微生物DNA结合起到催化作用。③缓冲液。缓冲液常与DNA聚合酶一起使用，增强聚合酶活性，避免其受到外界因素的影响。在缓冲液的保护下，可促使引物与微生物之间发生联系的概率进一步提升。④Zn2+离子，增强聚合酶的活力。其浓度对PCR产物的数量起到一定影响，因此在检测过程中需要对该离子浓度严格掌控，避免所测量的结果有偏差[2]。

4 PCR技术在食品微生物检测中的应用

4.1 大肠杆菌的检测

大肠杆菌具有一定毒素，且该毒素存在一致性，传统微生物检测技术无法精准的检测出来。而PCR技术运用特殊方式，可实现对该微生物的检测。也有研究人员利用免疫磁分离技术在牛肉中检测到了大肠杆菌，并利用stx1、stx2、hly等基因分析了大肠杆菌的类型。总之，较比血清法检测，多重PCR技术的检测方式更加灵敏、精准。

4.2 沙门氏菌

食品在制作加工过程对沙门氏菌造成一定影响，会降低其含量，因此该类型微生物在食品中的含量较低，也正因此，对食品微生物检测的结果将造成一定影响。通常使用invA、B、C、E等特异引物，来构建多重PCR。检测结果显示，单一的PCR与二重PCR检测结果基本没有差异，但利用三重PCR检测的结果将更加精准。众多研究人员在试验中，利用特异性引物，在冻家禽肉中检测到了沙门氏菌，并判断出其中血清的流行情况[3]。

4.3 乳酸菌中的微生物检测

当前，大部分乳酸菌为有益菌，可实现人体肠道功能的改善、促进胃肠蠕动等。但少部分乳酸菌对人体会造成一定伤害，因此在购买过程中需要对乳酸菌着重关注，这也要求工作人员对乳酸菌的检测更加仔细。我国对乳酸菌的检测工作开始时间较早，研究人员发现乳酸菌DNA序列中，1414～1432位置上的碱基具有代表性，且具有普遍性。因此，对当前乳酸菌的检测主要针对该位置上的碱基进行排列，判断乳酸菌性质。当前普遍采用SDS方法对乳酸菌进行细胞分裂，继而利用蛋白酶去掉其中蛋白质，再将提前准备好的引物与其结合，完成实验研究。由于该片段仅存在于乳酸菌上，因此不会担心引物与其他物质发生反应，以此便轻松地实现对乳酸菌含量的检测。

4.4 对啤酒中微生物的检测

随着生活质量的提升，啤酒成为人们生活中常见的食品。我国啤酒种类多、产量大，其微生物检测相对存在一定复杂性特点。根据啤酒的制作方法可知，啤酒由发酵得来，且其中最重要的微生物便是乳酸杆菌。啤酒原料中含有异维A酸，具有抑菌作用，但由于乳酸杆菌的特殊性，对异维A酸将造成一定影响。有研究表示，啤酒的腐败与乳酸杆菌具有密切联系。经研究发现，软杆菌能够对异维A酸起到一定抑制作用。日本的科研人员对horA基因的顺序进行了研究，合成特异引物，并利用聚合酶与乳杆菌的提取液，利用电泳对合成产物进行检测，得到了十分接近的结果。以此，啤酒中腐败菌检测的手段被研发出来，并在时间上具有强大优势，仅需要6 h。

4.5 对致病菌的检测

食品中存在的致病菌对人体将造成较大的危害，甚至引发疾病，包括衣原体、支原体、病毒等。为给人们创造健康的饮食环境，需要将致病菌控制在合理范围内，并进行严格的检测。因此，采用PCR技术，将致病菌样本提前准备，并利用高速离心的方式将致病菌分离。在一定温度条件下，其将发生裂解，工作人员在其裂解过程中得到核酸。再将致病菌的DNA加以分析，得到具有代表性的片段。在确定片段后，将特异引物与之结合，最后得到致病菌DNA序列。在该工作中判断其是否具有之前选好的靶DNA片段，继而得出其是否为该致病菌细胞。经过多次试验，PCR技术在该类微生物检测过程中具有较强的优势，时间短、见效快。

5 展望

按照实际特定选择特异引物，使用专业的手段对DNA进行检测，可实现对食品微生物的检测目的[4]。经过一系列流程，可对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等众多微生物进行检测，效率较高、时间较短。可见，PCR技术在微生物检测中占据重要地位。在未来的发展中将进一步提升PCR的研究水平，缩短时间。传统微生物检测需要2～5天，但PCR技术通常为几个小时，最长不会超过一天。在不断的研究过程中，可进一步缩短时间，提升检测效率。与此同时，需要进一步研究该技术的特异引物，增加原料的使用。促使其在使用过程中，对食品微生物检测精准度进一步提升，强化我国食品行业的发展，以及科技运用能力。

6 结论

本文阐述了PCR技术，并针对其的实际应用加以分析。得出其在各种微生物检测中的重要作用。其中，多重PCR技术的使用可在一定程度上提升该技术的结果精准度。同时，荧光探针定量技术、变性梯度凝胶电泳等技术的综合利用，也将进一步实现食品微生物检测的灵敏度，并实现复杂的、大量的微生物检测。