黑蒜多糖的提取及其抗氧化性研究

◎ 杨延存，蔡甜甜，于海坤，侯笑林

（青岛工学院，山东 青岛 266300）

黑蒜是利用新鲜生蒜，带皮在发酵箱里发酵60～90 d后制成的食品，黑蒜以超高营养价值以及“甜、软、糯”的口感正逐渐被人们认识和认可，并走向百姓生活[1]。黑蒜食后无蒜臭，与普通大蒜所不同。各类文献显示，各种多糖在增强机体免疫力、抗炎症、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗辐射、抗菌抗病毒和保护肝脏等多方面的生物活性已相继被发现，它的作用几乎涉及机体免疫系统的各个方面[2-4]。作为多糖的一种，黑蒜多糖的提取方法仍在不断地改进[5]，本研究拟采用木瓜蛋白酶辅助水提醇沉法提取黑蒜粗多糖，建立一种简便易行、适合常规实验室、具有一定稳定性的黑蒜多糖含量提取方法，为进一步研究黑蒜多糖提供科学根据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

黑蒜（网上采购，新鲜、无公害、无糜烂）。

1.2 仪器与设备

750T型多功能粉碎机（铂欧五金厂），KH5200B型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）、80-2电动离心机（上海梅香仪器有限公司），722N型分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司），101-3A型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司），旋转蒸发器RE-52A（上海亚荣生化仪器厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 提取流程[6]

黑蒜→粉碎→脱脂→加入蒸馏水及酶→一定条件超声→灭酶→离心取上清液→蒸发浓缩→除蛋白质→醇沉取沉淀→洗涤→醇沉取沉淀→干燥→溶解→测吸光度。

1.3.2 黑蒜中多糖含量的测定及计算方法[7]

精确称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖100 mg于500 mL容量瓶中，加蒸馏水定容。分别量取0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL和1.0 mL标准溶液于25 mL试管中，加蒸馏水2.0 mL并摇匀。分别加入新配制的苯酚试剂1.2 mL、浓硫酸5 mL，摇匀，放置5 min，沸水浴中加热15 min。取出后冷却至室温。以蒸馏水2 mL加苯酚和硫酸，同上做空白对照。于490 nm波长处测定吸光度，以葡萄糖含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，制作标准曲线，得到标准曲线的回归方程。

称取干燥后的黑蒜粗多糖，加入200 mL容量瓶中，蒸馏水定容。量取0.5 mL，按上述方法测吸光度，代入方程，求多糖含量。

式中：C为在标准曲线上查出的糖含量，mg/mL；V总为提取液总体积，mL；V测为测定时取用体积，mL；W为样品重量，mg；D为稀释倍数。

1.3.3 单因素试验

（1）酶用量对黑蒜多糖提取率的影响。准确称取5.0 g脱脂黑蒜粉，按1∶30（g/mL）料液比加入蒸馏水，分别加入质量分数为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%的木瓜蛋白酶，在pH 5.0、提取温度50 ℃条件下超声提取60 min，按工艺流程进行多糖提取。以多糖提取率为评价指标进行评定，确定最佳酶用量。平行两次试验，下同。

（2）酶作用pH对黑蒜多糖提取率的影响。准确称取5.0 g脱脂黑蒜粉，按1∶30（g/mL）料液比加入蒸馏水，加入质量分数为1.5%的木瓜蛋白酶，调节溶液pH分别为5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，在提取温度为50 ℃条件下超声提取60 min，按工艺流程进行多糖提取。以多糖提取率为评价指标进行评定，确定最佳酶作用pH。

（3）提取温度对黑蒜多糖提取率的影响。准确称取5.0 g脱脂黑蒜粉，按1∶30（g/mL）料液比加入蒸馏水，加入质量分数为1.5%的木瓜蛋白酶，调节溶液pH为5.0，分别在提取温度为45、50、55、60 ℃和65 ℃条件下超声提取60 min，按工艺流程进行多糖提取。以多糖提取率为评价指标进行评定，确定最佳提取温度。

（4）超声时间对黑蒜多糖提取率的影响。准确称取5.0 g脱脂黑蒜粉，按1∶30（g/mL）料液比加入蒸馏水，加入质量分数为1.5%的木瓜蛋白酶，调节溶液pH为5.0，在提取温度为50 ℃条件下分别超声20、40、60、80 min和100 min，按工艺流程进行多糖提取。以多糖提取率为评价指标进行评定，确定最佳超声时间。

1.3.4 正交试验

根据单因素试验结果，选酶用量、酶作用pH、提取温度、超声时间四因素进行正交试验，每个因素设计3个水平，以多糖提取率为评价指标，设计L9（34）正交试验，优化黑蒜多糖提取工艺条件。

1.3.5 黑蒜多糖抗氧化活性的测定

（1）DPPH清除作用的测定[8,9]。以维生素C为阳性对照。在试管中按顺序加入2.5 mL 6×10-5mol/L DPPH溶液，一定体积的黑蒜多糖提取液、维生素C，用蒸馏水补足到4 mL，对照管用蒸馏水代替，各管混匀，避光20 min，于517 nm处测定吸光度值，计算清除率。

式中，A1为4 mL样液+2 mL DPPH对应吸光度值；A2为4 mL样液+2 mL 95%的乙醇对应吸光度值；A3为4 mL蒸馏水+2 mL DPPH对应吸光度值。

（2）羟自由基（•OH）清除作用的测定[10]。以维生素C为阳性对照。取0.2 mL 10 mmol/L FeSO4-EDTA混合液，0.2 mL 10 mmol/L 2-脱氧核糖溶液，1.0 mL待测液，0.4 mL PBS液，0.2 mL 10 mmol/L过氧化氢溶液，置于37 ℃恒温水浴中1 h，在532 nm处测定其吸光度As。用1.0 mL蒸馏水代替待测液作对照，测得吸光度为A0，计算清除率SA。

（3）黑蒜多糖对大豆油抗氧化能力的测定[6]。将加入黑蒜多糖的菜籽油试样按照质量百分比0.5%搅拌均匀，然后置于60 ℃的烘箱自氧化，每24 h取样测定菜籽油的过氧化值（POV）。按GB/T 5538-2005测定油脂的过氧化值，过氧化值以每千克中活性氧的毫克当量表示。

式中，V1为试样消耗Na2S2O3体积，mL；V2为空白消耗Na2S2O3体积，mL；C为Na2S2O3浓度，mol/L；m为试样质量，g。

2 结果与分析

2.1 酶用量对黑蒜多糖提取率的影响

由图1知，随着酶用量的增加，黑蒜多糖的提取率增加，当酶用量达到1.5%时，黑蒜多糖提取率达到最大值；随着酶用量继续增加，多糖提取率呈现下降趋势。这可能是因为酶添加量少于1.5%时，反应中底物浓度过量，反应速度取决于酶浓度，在此时，底物的有效转化随着酶浓度的增加而呈直线的增加，多糖的提取率随之升高；酶浓度在1.5%～2.5%时，酶添加量相对于底物浓度过量，底物在酶的作用下就会首先分解掉一部分非目标产物，进而分解掉从底物中溶出的黑蒜多糖。所以对于黑蒜多糖的提取率来说存在一个最佳的酶浓度，为了缩短工时、节约资源，选酶用量1.5%为宜。

图1 酶用量对黑蒜多糖提取率的影响图

2.2 酶作用pH对黑蒜多糖提取率的影响

由图2可以看出，随着pH的增加，黑蒜多糖提取率逐渐增加，当pH为6.0时，黑蒜多糖提取率达到最高；随着pH的继续增加，黑蒜多糖提取率反而呈下降趋势。原因可能是酶对pH非常敏感，每一种酶都是在一定pH范围内发挥作用，如果环境中的pH超出这个范围，酶的活性就会降低甚至失去活性，只有在一定pH范围时，其活性才会达到最高，该值即是酶的最适pH，偏离此值，无论pH是增加还是减小，酶的活性都会降低，进而导致黑蒜多糖提取率的降低。因此，黑蒜多糖提取的最适pH为6.0。

图2 酶作用pH对黑蒜多糖提取率的影响图

2.3 提取温度对黑蒜多糖提取率的影响

从图3可以看出，随着酶解温度的升高，黑蒜多糖的提取率增加，当温度达到55 ℃时，黑蒜多糖的提取率达到最大；当酶解温度继续升高时，提取率下降。这可能是因为温度不仅影响多糖的溶出速度，而且影响木瓜蛋白酶的活性，随着温度的升高，木瓜蛋白酶的酶解活性增加，进而使得黑蒜多糖提取率升高。但当温度超过55 ℃时，过高的温度影响了酶的活性，导致木瓜蛋白酶活性降低甚至丧失，从而影响黑蒜多糖的提取率，因此最佳提取温度为55 ℃。

图3 提取温度对黑蒜多糖提取率的影响图

2.4 超声时间对黑蒜多糖提取率的影响

由图4可以得知，黑蒜多糖提取率随着超声时间的延长而逐渐升高，提取率在20～80 min内增加明显，且在80 min时达到最大，之后，随着超声时间的增加，提取率开始下降。这可能是由于某些糖苷键因提取时间过久在蛋白酶的催化作用下被分解，或是提取时间过长引起多糖结构发生变化，甚至使碳环裂解导致。因此，为减少提取过程中黑蒜多糖的损失，选取80 min为最佳超声时间。

图4 超声时间对黑蒜多糖提取率的影响图

2.5 正交试验优化

由表1可知，试验中四个因素的影响力大小顺序为C＞A＞B＞D，对应影响黑蒜多糖提取率效果因素的强弱顺序为提取温度＞酶用量＞酶作用pH＞超声时间，且黑蒜中多糖的最佳提取工艺为A2B3C2D1。由于计算出的最优组合不包含在正交表中，因而按最优组合配方进行验证试验，得出黑蒜多糖的最佳提取率为10.15%，高于A2B1C2D3，因此确定A2B3C2D1为提取黑蒜多糖的最佳工艺条件，即酶用量为1.5%、酶作用pH为6.5、提取温度为55 ℃、超声时间为75 min。

表1 正交试验结果表

2.6 黑蒜多糖与维生素C对DPPH清除率的效果差异

由图5可知，维生素C与黑蒜多糖对DPPH均有较强的清除作用。维生素C在浓度0.05～0.25 mg/mL的范围内对DPPH的清除率基本保持缓慢升高的变化趋势，而黑蒜多糖则表现出随浓度的升高，清除率快速增长的趋势，清除能力逐渐增强，即抗氧化性也是逐渐增强，但与相同浓度条件下的维生素C相比，其对DPPH自由基的清除率明显要低，可见黑蒜多糖的抗氧化能力弱于维生素C。

图5 黑蒜多糖与维生素C对DPPH清除率的效果差异图

2.7 黑蒜多糖与维生素C对•OH清除率的效果差异

由图6可知，维生素C与黑蒜多糖对•OH均有较强的清除作用，都随浓度的增大而升高，在浓度为0.2～0.6 mg/mL范围内清除率快速增长，在0.6～1.0 mg/mL范围内增长缓慢。但黑蒜多糖与相同浓度条件下的维生素C相比，其对•OH的清除率明显要低，清除效果弱于维生素C。

图6 黑蒜多糖与维生素C对•OH清除率的效果差异图

2.8 黑蒜多糖与维生素C对大豆油抗氧化能力的效果差异

从图7可以看出，随着放置时间的延长，大豆油的POV值呈上升趋势，即大豆油易被氧化。加入了黑蒜多糖和维生素C的样品较空白上升的缓慢，同时加入相同浓度黑蒜多糖的样品较加入维生素C的样品POV值要小，表明黑蒜多糖可以较维生素C更有效的抑制大豆油的氧化，黑蒜多糖对大豆油的抗氧化能力强于维生素C。

图7 黑蒜多糖与维生素C对大豆油的抗氧化的效果差异图

3 结论

木瓜蛋白酶辅助水提醇沉法提取黑蒜多糖的最佳提取条件为酶用量为1.5%、酶作用pH为6.5、提取温度为55℃、超声时间为75 min，由此工艺条件下提取的黑蒜多糖提取率可达10.15%。

黑蒜多糖对DPPH和•OH均表现出较强的清除能力，在一定浓度范围内，清除率随浓度的增大而升高，但与维生素C相比，黑蒜多糖的清除效果要差，而黑蒜多糖对大豆油的抗氧化能力较维生素C强，能够有效抑制大豆油的氧化。