P-选择素基因多态性对冠心病患者PCI术后血小板抑制率、MA-ADP及血小板活化指标的影响

尹富禹，卢欣，吴晓鹏

冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）是我国更是全球范围面临的最重要的公共卫生问题之一。目前，经皮冠状动脉介入治疗（PCI）是临床最重要的血运重建一线治疗方案，大大降低了患者死亡率，但PCI术后支架内再狭窄仍是影响长期预后的顽疾[1]。术后辅以阿司匹林和氯吡格雷双联抗血小板药物对于预防PCI围手术期不良心血管事件的发生尤为重要[2]。氯吡格雷是血小板表面二磷酸腺苷（ADP）受体拮抗剂，具有不可逆抑制血小板聚集作用[3]。P-选择素是一种表达在活化的血小板表面的、富含半胱氨酸高度糖化的I型跨膜蛋白，与血小板的粘附和聚集密切相关[4]。研究显示，P-选择素基因含有多个脆性位点[5]，但这些位点的单核苷酸多态性（SNPs）与氯吡格雷反应性的关系尚无定论，尤其是西部人群中P-选择素基因多态性的研究十分鲜见。在西安地区汉族人群中进行了P-选择素基因多态性初步研究，分析PCI术后患者服用氯吡格雷后血小板抑制率、ADP诱导的最大凝块强度（MAADP）及反映血小板活性指标，如血管扩张刺激磷蛋白（VASP）、可溶性CD40（sCD40）、P-选择素水平的变化与P-选择素基因多态性关系，为临床用药提供新思路，报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料随机选取2015年3月～2016年12月于西电集团医院顺利完成PCI术的冠心病患者374例，其中男性209例，女性165例，年龄43～81（63.85±9.42）岁，记录受试者的一般临床资料。本研究已获西电集团医院伦理委员会批准。1.2 患者入选和排除标准入选标准：①在本地居住20年以上的汉族患者；②由2位介入专家进行冠状动脉造影确诊为冠心病并具有行PCI术的指征（血管狭窄≥75%）；③既往未接受过PCI术治疗；④所有患者均完成P-选择素基因测序；⑤获得患者及家属对本项研究的知情同意并签署知情同意书。排除标准：①不符合上述纳入标准的患者；②患者在治疗前出现严重的意识障碍、心力衰竭、伴有严重的肝肾功能不全、恶性肿瘤、血液系统疾病、急慢性感染或伴有严重出血倾向者；③预计生存时间≤1年者；④相互间有血缘关系者；⑤阿司匹林和氯吡格雷禁忌症者。

1.3 研究方法

1.3.1 患者一般资料包括年龄、性别、体质指数（BMI）、收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、糖尿病史、血脂异常史、高血压史、吸烟史等。

1.3.2 治疗方法术前口服负荷剂量硫酸氢氯吡格雷片（商品名：波立维®，生产厂家：杭州赛诺菲制药有限公司；生产批号：国药准字J20130083）300 mg+阿司匹林肠溶片（商品名：拜阿司匹林®，生产厂家：拜耳医药保健有限公司；生产批号：国药准字J20130078）300 mg。

1.3.3 血液样本采集采集所有患者PCI术后3 d服药2 h后的外周静脉血5 ml，其中1 ml置于含有依地酸二钠（EDTA-Na）抗凝剂的采血管中，用于检测生化指标；其余血液样本于-70℃低温保存，用于进行DNA提取。

1.3.4 血液常规检查采用SYSMEX XS-800i全自动血液细胞分析仪（日本希森美康公司）进行血液常规检测。严格按照仪器操作手册进行操作，所有检测在2 h内完成。包括糖化血红蛋白（HbAlc）、空腹血糖（FPG）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）等生化指标。

1.3.5 血小板抑制率和MA-ADP采用5000型血栓弹力图（TEG）凝血分析仪（美国Haemoscope公司）检测血小板抑制率，血小板抑制率=[（MAADP-MAfibrin）/（MAthrombin-MAfibrin）]×100%。MA-ADP表示ADP诱导的血凝块强度；MAfibrin表示纤维蛋白的凝块强度；MAthrombin表示凝血酶诱导的凝块强度。TEG软件根据检测结果自动计算经ADP 途径诱导的血小板抑制率及MA-ADP。将ADP受体抑制率＜20%定义为氯吡格雷抵抗。

1.3.6 血液生化指标采用流式细胞仪技术检测VASP、sCD40及P-选择素（CD62p）的水平。试剂盒购自上海百奥生物科技有限公司；单克隆抗体由美国Abcam公司提供。分别计数104 血小板中与荧光抗体VASP、sCD40和CD62p结合的血小板数（阳性血小板），其中阳性血小板百分率用于表示ASP、sCD40和CD62p的表达水平。

1.3.7 基因多态性检测方法①采用Primer Express软件（美国Applied Biosystems公司）设计引物和探针，由上海生工生物工程有限公司合成并提供。②外周血白细胞DNA提取：采用基因组DNA小量抽提试剂盒（由北京天根生物技术有限公司提供）。具体提取方法参照说明书进行。采用紫外分光光度法测定DNA质量和浓度。③进行PCR-RELP：取8 μl PCR扩增产物，加入2 μl 10×Buffer和1 μl特异性限制性内切酶（购自大连宝生生物工程有限公司），然后加入9 μl去离子水，于37℃反应12～14 h。④将PCR产物进行电泳检测。⑤基因测序：将50 μl测序样品送至上海生工生物工程有限公司进行纯化测序。根据Hapmap公共数据库选择P-选择素基因的脆性位点，即-2123G/C、-1969G/A、-1817T/C位点。进行大批量扩增，电泳，酶切，确定基因型。

1.4 统计学处理采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，采用拟合优度χ2检验计算对照组的基因型分布是否符合 Hardy-Weinberg 平衡。符合正态性分布的计量资料均以均数±标准差（±s）表

2 结果

2.1 基因型分析本研究中，374例冠心病患者P-选择素基因型检出率为100%。-2123G/C位点基因型有3种，CC基因型（152 bp和95 bp，2条带），GC基因型（247 bp、152 bp、95 bp，3条带），GG基因型（247 bp，1条带）；-1969G/A位点基因型有3种，AA基因型（101 bp和69 bp，2条带），GA基因型（170 bp、101 bp、69 bp，3条带），GG基因型（170 bp，1条带）；-1817T/C位点基因型有3种，TT基因型（141 bp和74 bp，2条带），TC基因型（215 bp、141 bp、74 bp，3条带），CC基因型（215 bp，1条带）（图1）。

2.2 所有受试对象基因型分布P-选择素基因-2123G/C、-1969G/A、-1817T/C位点在受试人群中的基因分型符合Hardy-weinberg平衡规律，其中-2123G/C位点（χ2=0.929，P＞0.05），-1969G/A位点（χ2=2.371，P＞0.05），-1817T/C位点（χ2=1.174，P＞0.05），表明受试对象的基因型分布可反映整体人群基因的分布情况（表1）。

表1 研究人群的基因型分布

图1 P-选择素基因位点电泳结果

2.3 P-选择素基因多态性对血小板抑制率、MA-ADP以及血小板活化指标的影响本项研究中，-2123G/C位点CC型基因携带者其血小板抑制率和VASP水平均较GG型、GG型基因携带者低，而MA-ADP、sCD40、CD62p水平则相对较高，差异有统计学意义（P＜0.05）。但是-1969G/A位点和-1817T/C位点不同基因型携带者血小板抑制率、VASP、MA-ADP、sCD40和CD62p水平未见统计学差异（P＞0.05）（表2）。

表2 受试对象的基因型分布

2.4 受试对象临床基线资料比较在本项研究中，75例（20.05%）患者发生氯吡格雷抵抗，其余299例（79.95%）患者反应正常。比较两组患者的基线临床资料，两组患者年龄、性别组成、BMI、血压、HbAlc、血脂水平、高血压病史、血脂代谢异常史、吸烟史无统计学差异（P＞0.05）。此外，氯吡格雷抵抗组有糖尿病史的患者比例明显高于氯吡格雷反应正常者，差异有统计学意义（P＜0.05）（表3）。

2.5 氯吡格雷抵抗组和非抵抗组患者P-选择素基因型分布结合DNA测序技术确定了374例患者P-选择素基因-2123G/C、-1969G/A、-1817T/C位点SNPs。其基因型分布如下，-2123G/C位点：54例氯吡格雷抵抗患者为GG野生型+GC杂合型，21例为CC突变型；-1969G/A位点：69例氯吡格雷抵抗患者为GG野生型+GA杂合型，6例为AA突变型；-1817T/C位点：49例氯吡格雷抵抗患者为TT野生型+TC杂合型，26例为CC突变型。经多因素COX风险比例回归模型分析，P-选择素基因的-2123G/C位点与氯吡格雷抵抗的发生风险密切相关（P＜0.05）。校正年龄、血脂指标、糖尿病史后，-2123G/C位点仍然是发生氯吡格雷抵抗的独立影响因素（P＜0.05）。未见P-选择素基因-1969G/A位点和-1817T/C位点SNPs与氯吡格雷抵抗的关系（P＞0.05）（表4）。

3 讨论

冠心病作为一种严重危害人类健康的心脑血管疾病之一，死亡率和致残率较高，病因复杂，给患者家庭增加了极大的经济负担。随着我国冠心病人数的增加以及PCI术的推广，服用氯吡格雷的患者数量也逐年增加，氯吡格雷反应变异性已经成为心血管领域研究的重点。有文献报道，在汉族人群中氯吡格雷抵抗的发生率约为4%～31%[6]，本研究中纳入的374例患者中，75例（20.05%）患者发生氯吡格雷抵抗。氯吡格雷属于新型抑制血小板聚集的噻吩砒啶类衍生物，主要通过不可逆地阻断二磷酸腺苷受体，抑制纤维蛋白原与GPⅡb/Ⅲa受体结合，从而抑制血小板聚集[7]。理论上，氯吡格雷具有很强的抗血小板活性作用，在实际应用中，部分患者服用氯吡格雷血小板后无反应或低反应[8]。目前关于氯吡格雷抵抗的发生机制不明，普遍认为血小板活化因子在氯吡格雷抵抗发生过程中发挥了重要作用。

表3 氯吡格雷抵抗组和非抵抗组患者的基线资料比较

P-选择素是一种高表达于活化血小板表面的、富含半胱氨酸高度糖化的整合I型跨膜蛋白，参与细胞间的选择性识别与粘附，介导血小板活化、相互之间粘附聚集等过程，是目前发现的最具有特异性的血小板活化标志分子[9]。氯吡格雷抵抗与多种因素密切相关，包括年龄、肥胖、吸烟、疾病史、遗传因素等[10]，很多文献报道相关功能蛋白基因的多态性是影响氯吡格雷反应变异性一个重要因素[11]，研究较多的是CYP2C19基因[12]，但鲜少见到探讨P-选择素基因多态性与氯吡格雷抵抗的关系。P-选择素基因同样也存在多个脆性位点，本研究着重分析亚洲人群最易发生突变的P-选择素基因-2123 G/C、-1969 G/A和-1817 T/C位点的多态性与氯吡格雷抵抗的关系。国内曾进行一项大样本调查研究，发现汉族人群与泰国人群P-选择素基因启动子区-2123C/ G、-1969G/A、-1817T/C 位点基因多态性不存在统计学差异[13]，但与白种人群，如英国、美国等比较，这三个位点的基因型及等位基因频率分布有显著统计学差异[14]。本研究纳入的受试对象P-选择素基因型分布符合Hardy-weinberg平衡规律。-2123G/C位点：54例氯吡格雷抵抗患者为GG野生型+GC杂合型，21例为CC突变型；-1969G/A位点：69例氯吡格雷抵抗患者为GG野生型+GA杂合型，6例为AA突变型；-1817T/C位点：49例氯吡格雷抵抗患者为TT野生型+TC杂合型，26例为CC突变型。经多因素 COX 风险比例回归模型分析，P-选择素基因的-2123G/C位点CC突变型可能是发生氯吡格雷抵抗的独立危险因素。除外还发现-2123G/C位点CC型基因携带者其血小板抑制率和VASP水平均较GG型、GG型基因携带者低，而MA-ADP、sCD40、CD62p水平则相对较高。但-1969G/A位点和-1817T/C位点不同基因型携带者血小板抑制率、VASP、MA-ADP、sCD40和CD62p水平未见统计学差异。P-选择素基因-2123G/C位点多态性与氯吡格雷抵抗的发生风险相关。

表4 P-选择素基因型与氯吡格雷抵抗的关系分析

综上所述， P-选择素基因-2123G/C位点多态性是导致氯吡格雷抵抗的一个重要原因。P-选择素基因与血小板活化和聚集密切相关，P-选择素基因的多态性研究处于起步阶段，大量信息和脆性位点有待于深入研究，但本研究结果仍为解释氯吡格雷抵抗的发生机制及冠心病PCI术后抗血小板治疗提供了一定指导价值。需强调的是P-选择素基因多态性只是氯吡格雷抵抗发生的重要因素之一[15]，尚需更多中心、大规模的研究来证实。