动物早期胚胎体外培养的研究进展

孙思怡，李 琦，张 帆，韩淑敏，李雁冰，李井春，魏国生

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

近年来，胚胎体外培养作为动物繁殖的重要手段越来越受到重视。将胚胎在体外培养至桑椹胚或囊胚后再进行移植能有效地提高繁殖效率，但同时也存在胚胎质量差、囊胚率低、基因变异率高等问题。随着相关学者的不断研究，目前进展较为顺利，在一定程度上改善了这些问题。早期胚胎体外培养采用模拟母体体内生理环境的方法构建培养环境，获得了较好的培养效果。此外，培养液配方和胚胎培养体系的改良也一直是研究的热点。培养液的改良方法主要是在已有的基础培养液中添加一些物质，以期达到提高囊胚率、改善胚胎质量以及克服发育阻断的效果。胚胎培养体系也由最初的静置培养体系逐渐发展为动态培养体系，更为接近体内发育环境。由于胚胎的体外培养受多因素影响，因此，综合培养液成分和培养环境等因素进行整体效应考虑，对胚胎体外培养的研究更为有利。

1 早期胚胎体外培养的培养环境

对早期胚胎体外培养影响较大的环境因素有温度、气相环境、渗透压及pH值。早期胚胎对温度较为敏感，在胚胎体外培养过程中较为常用的温度为37～39℃，对不同动物来说最适宜的温度略有差异［1］。胚胎的生存必须依赖氧气，但氧浓度过高并不利于胚胎的发育，因此，保证低氧环境对胚胎的体外培养是必要的。在较高的氧气压力下，外侧的卵裂球将以较慢的速率分裂并形成滋养外胚层，而在较低的氧气张力下内侧的卵裂球将更迅速地分裂并且促成内细胞团块。有试验证明，氧张力对牛囊胚中的组蛋白标记H3K9me2（抑制性）和 H3K4me2（允许性）具有重要影响［2］。 在人类卵母细胞和胚胎体外培养过程中，5%O2条件下胚胎着床率和卵裂率显著高于20%O2条件下［3］。但最近也有数据表明，胚胎培养的最佳氧气张力可能取决于发育阶段［4］。有研究表明，人体外受精胚胎采用低氧环境培养可能有助于提高胚胎发育潜能［5］。目前常规培养系统中多使用5%O2培养条件，但由于氧浓度与不同培养系统的相互作用的差异导致5%O2对不同培养系统的作用结果不同。除了氧浓度以外，胚胎的生存对CO2浓度也有一定的要求。到目前为止，胚胎体外培养仍主要采用5%CO2的气相环境。 培养液中含有 Na+、Cl-、K+、Mg2+、Ca2+、PO43-、SO42-、HCO3-等无机盐成分。 Na+和 Cl-主要作用是调节渗透压；HCO3-作为缓冲剂可调节培养液的pH值，是哺乳动物胚胎培养液中较为重要的一种，胚胎发育较适宜的 pH 值为 7.1～7.4［6］；在卵裂阶段，提高K+浓度、降低Na+浓度对胚胎的发育是有利的。

2 胚胎培养液的添加物

输卵管和子宫的生理环境对早期胚胎的正常发育有很大的影响，因此，在体外培养时，需尽量使培养液达到体内发育的相关条件。胚胎培养液中的主要添加物有无机盐、能量底物、氨基酸、维生素、激素、蛋白成分和生长因子等，为胚胎的正常发育提供一个相对适宜的环境。近年来，对培养液中的添加物进行调整以完善配方，确保胚胎拥有更好的体外培养环境一直是相关研究的热点。研究者根据试验的目的、方法等因素会选择不同的培养液，目前较为常用的胚胎体外培养液有TCM199、Ham′s F10、SOF、CR1、CZB 等［7］。Pinyopummintr等［8］研究表明，在牛卵裂期胚胎发育阶段具有选定底物的简单培养基可以支持早期发育，效果比复合培养基更好。

2.1 能量底物

胚胎在体外发育过程中，最基本的生命活动即是能量代谢，因此，能量底物是胚胎培养液中必不可少的一种成分。胚胎在体内发育过程中，主要的能源物质有丙酮酸、乳酸和葡萄糖等。随着胚胎的发育，早期胚胎在不同阶段所需的能量底物的浓度有所不同，作用亦有不同，不同物种之间也存在差异。小鼠、绵羊、牛及人的早期胚胎主要以丙酮酸、乳酸和氨基酸为能量代谢的底物，对葡萄糖的利用能力则很有限，甚至在一些不含氨基酸的培养液中，葡萄糖还会抑制早期胚胎的发育，因此，在SOF、CR1、CZB等主流培养液中均不含有葡萄糖。而丙酮酸和乳酸作为哺乳动物早期胚胎卵裂阶段的主要供能物质，在多数胚胎培养液中都有添加，是胚胎培养液中重要的添加物。有试验结果显示，丙酮酸和乳酸是猪胚胎早期阶段的首选能量底物［9］。有研究者认为，在SOF培养液中加入葡萄糖是不必要的，会对桑椹胚发育产生不利影响，而丙酮酸盐和乳酸能支持早期胚胎发育到桑椹胚阶段［10］。但也有学者认为葡萄糖对卵裂阶段胚胎的发育有一定抑制作用，对桑椹胚以后的胚胎发育却有一定促进作用，而且早期胚胎虽不以葡萄糖为能量底物，但也存在于母体动物的输卵管和子宫液中，因此，在早期胚胎体外发育中添加葡萄糖并非完全没有必要［11］。

2.2 氨基酸

氨基酸是蛋白质合成的前体和参与胚胎能量代谢的物质，分为必需氨基酸（EAA）和非必需氨基酸（NEAA）。研究显示，NEAA可以为早期胚胎提供营养物质，并显著提高早期胚胎的囊胚发育率［12］。在培养液中添加NEAA还能显著提高许多动物胚胎的囊胚细胞数量，有利于早期胚胎的发育，但培养液中氨基酸的代谢产物胺对早期胚胎的发育有一定损害［13］，因此，在考虑培养液营养物质供应问题的同时也要注意添加量，尽量避免对早期胚胎的损伤［14］。许多研究表明，氨基酸是牛早期胚胎发育必不可少的，20种常见氨基酸能显著提高牛羊的囊胚率［15］。 Fouda［16］研究发现，通过在TCM199中添加50 μL水平的EAA和NEAA可以改善兔4细胞和8细胞阶段胚胎的发育能力，使其发育到囊胚期的成功率提高。N，N-二甲基甘氨酸能降低氧化应激，改善牛胚胎的体外发育［17］。1.0 mmol/L甘氨酸能改善早期和晚期阶段的胚胎发育，尤其是在早期阶段更为显著［18］。半胱氨酸和胱氨酸降低了由H2O2引起的氧张力，从而克服体外培养的山羊胚胎中的氧化应激［19］。由于植入前哺乳动物胚胎的发育结果受周围微环境直接调节，因此，不适当的氨基酸浓度或氨基酸感应机制的丧失可能是有害的，并且会影响胚胎的进一步发育［20］。总之，氨基酸对动物早期胚胎的发育有利是显而易见的，但对于在培养液中添加的氨基酸种类以及适宜的浓度仍需学者们进一步研究。

2.3 抗氧化剂

在目前模拟体内输卵管及子宫的低氧环境的培养系统中，活性氧（ROS）被认为是影响胚胎发育的一个重要因素。早期胚胎对氧化损伤十分敏感，且体外培养活性氧浓度较体内发育环境高，降低早期胚胎体外培养过程中的活性氧浓度能使体外培养更贴近胚胎体内发育的氧环境。在正常生理条件下，体内胚胎发育受多种抗氧化物质调控，使活性氧达到一个平衡状态，如牛磺酸、亚牛磺酸、VC、过氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷氨酰半胱氨酸合成酶等。在体外培养时，则需要添加抗氧化剂来降低活性氧浓度，以达到抗氧化损伤，使胚胎正常发育的目的。有研究表明，牛胚胎对氧化应激是敏感的，添加含谷胱甘肽的培养基可以促进体外胚胎发育［21-22］。除了谷胱甘肽以外，还有一些常见的天然抗氧化剂对体外胚胎发育的改善有利，比如VC和VE能清除自由基，保护细胞膜；番茄红素能通过克服体外培养系统中的一些不利条件来提高囊胚质量［23］；半胱氨酸能有效抑制NADPH氧化酶的活性，提高氧化损伤胚胎的抗氧化能力［24］。牛磺酸不仅能促进胚胎的新陈代谢，抵抗K+浓度过高引起的损害，还具有较好的抗氧化作用。在培养液中添加牛磺酸能有效清除氧自由基，有利于胚胎的正常发育［25］。有研究证实，在培养液中添加褪黑激素不仅可以达到抗细胞过氧化反应的目的，还能够克服早期胚胎的发育阻滞，提高体外胚胎的囊胚发育率及囊胚细胞数，提升囊胚质量［26］。 乙酰左旋肉碱、N-乙酰-L-半胱氨酸和α-硫辛酸3种抗氧化剂的组合使小鼠囊胚细胞数显著增加，并维持细胞内谷胱甘肽水平，改善胚胎发育及生存能力［27］。有研究表明，体外培养环境中小鼠胚胎发育阻滞与合子基因组激活（ZGA）相关基因的表达有关，线粒体参与调节细胞内ROS的动态平衡，从而对胚胎发育产生影响［28］。

2.4 蛋白质及大分子物质

一些蛋白质及大分子物质能供给胚胎营养，促进细胞生长、增殖与分裂，对提高早期胚胎囊胚率有积极作用。血清的成分十分复杂，其中含有氨基酸、生长因子、维生素、激素、矿物质及蛋白成分等多种早期胚胎所需的营养成分，因而对早期胚胎发育有重要作用，体现在保持细胞存活、促进细胞生长、维持细胞pH值及渗透压稳定、保障细胞膜完整性等多个方面。目前，较为常用的蛋白源添加物有胎牛血清（FCS）、新生犊牛血清（NCS）、发情母牛血清（OCS）、阉公牛血清（SS）和牛血清白蛋白（BSA）［1］。但由于血清含有一些仍未确定的物质，且血清产品易受到个体健康状况等因素的影响，具有一定的不确定性，对胚胎的影响十分多元化，所以不利于研究培养液中某一具体成分对早期胚胎的影响。近年来，在研究某种具体成分对胚胎体外发育的影响时，无血清培养液受到人们的关注，但在生产实践中，为了保证培养的效果和胚胎的质量，人们仍添加血清。BSA是培养液中较为常用的一种蛋白源物质，它能结合培养液中的一些胚胎毒性物质，对胚胎起到保护作用。BSA对山羊体外受精卵具有一定的促卵裂作用，能够提高早期胚胎囊胚率［12］。研究发现，在培养液中添加生长因子有利于胚胎克服发育阻断并提高胚胎的质量。如添加表皮生长因子（EGF）的培养液能提高猪早期胚胎的囊胚发育率［29］，EGF还能促进OXYS/lcgn株大鼠胚胎发育至胚泡阶段［30］；适宜剂量的转化生长因子TGF-β1可促进小鼠胚胎着床和发育［31］；在体外培养期间补充胰岛素样生长因子IGF-1可保护牛胚胎免受甲萘醌的有害作用［32］。

2.5 其他成分

在早期胚胎培养液中，还有一些添加物也对胚胎发育具有积极作用。作为胚胎发育的调节因子，一定浓度的激素在适当阶段对胚胎发育有促进作用。比如褪黑激素能够促进猪胚胎的体外发育［33］；胚胎培养液中较高水平的人绒毛膜促性腺激素（HCG）能提高人胚胎发育潜能［34］；Ghrelin 可以抑制促凋亡基因Bax的表达，促进抗凋亡基因Bcl-2的表达，进而促进绵羊早期胚胎的发育［35］。维生素在碳水化合物和氨基酸代谢过程中起重要作用，能促进细胞对葡萄糖的摄取和乳糖的合成，进而影响胚胎的发育。VK2能通过体外培养的牛胚胎线粒体恢复囊胚率［36］；VA的生理活性代谢物视黄酸（RA）通过核视黄酸受体（RARs）起作用，是胚胎发育过程中各器官系统形态的有效调节剂，也是成体组织稳态所必需的［37］。 Gardner等［38］研究显示，EDTA能抑制卵裂期胚胎的糖酵解活性，从而防止糖酵解的过早刺激从而促进发育。然而，EDTA不应该用于后期胚胎，因为它会抑制糖酵解，降低囊胚期的能量产生并显著抑制内细胞团的发育。除此之外，有最新研究发现，添加L-肉碱能提高猪胚胎的发育能力和抗冻性［39］。而为了防止胚胎在体外培养过程中被细菌污染，添加适量的抗生素也是很重要的。青霉素是一种高效、低毒、应用广泛的重要抗生素，也是常用的胚胎培养液添加物，而作为微生物源杀细菌剂的链霉素同样常被添加于胚胎培养液中。

3 胚胎培养体系的培养方式、方法

根据培养条件和需求的不同，胚胎的具体培养方法可分为常规培养系统、输卵管离体培养以及与体细胞共培养3种。常规培养系统是将胚胎单独在培养液中进行培养，而不添加其他细胞及其分泌因子的一种培养方法，分为微滴法和培养板法。前者是在塑料培养皿中制作30～100 μL的微滴，上面覆石蜡油，将胚胎置于其中培养，一般用于数量较少的胚胎培养；后者是直接将胚胎置于含500～800 μL培养液的四孔培养板中培养，一般用于数量较多的胚胎培养。经过胚胎培养液的不断改进和培养条件的逐步完善，该方法的效率和质量有了很大的提高，因此，成为目前胚胎体外培养的主要方法。而输卵管离体培养因较为烦琐和胚胎发育率不高等原因较少被使用。与体细胞共培养法可以利用体细胞生长过程中产生的有益因子克服发育阻断，从而促进胚胎发育，但随着培养液的不断改良，实验室更倾向于使用常规培养系统［1］。研究表明，共培养对克服小鼠早期胚胎发育阻滞作用较为明显，且输卵管上皮细胞共培养的效果优于卵丘细胞［40］。有研究者建立了小鼠早期胚胎与肿瘤细胞体外共培养模型，结果显示，早期胚胎与肿瘤细胞共培养可显著提高小鼠2细胞胚胎的体外发育效率［41］。近年来，虽然胚胎培养体系已从静置的微滴法逐渐发展为效果更好的动态微流体培养，但动态培养体系操作较为复杂，限制了其广泛应用，而静置培养体系则因培养效果稳定、易操作而一直占据主导地位，其中微滴法是目前最常用的培养方法［42］。

4 展望

近年来，随着猪、牛、羊等家畜的胚胎工程技术的不断进步，促进了畜牧业的蓬勃发展，为人类胚胎工程技术的进一步发展打下了坚实的基础。通过进一步完善培养液、改良培养系统以及根据胚胎的不同发育阶段设计不同培养液等方法，以期使体外培养环境更接近体内发育环境，解决由于脱离母体环境导致的一些问题，比如胚胎体外培养较体内发育质量差，卵裂球不够紧凑且质量不佳，囊胚率不高，移植后妊娠率不高等。相信随着科技的不断进步和相关学者的研究，目前动物胚胎体外培养存在的上述问题都将得到解决。

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