鹦鹉性别鉴定方法的研究进展

吴建民，梁 靓，王建发，武 瑞

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

鹦鹉属于鹦形目（Psittaciformes），有鹦鹉科和凤头鹦鹉科2个科、82个属、358个种，是当今鸟纲中最大的科之一，属于典型的攀禽，分布在世界各地的热带地区。鹦鹉以其靓丽的羽毛以及能够模仿人类语言等特点，被大多数人欣赏和爱护，因而经常被人们作为宠物饲养，而它们的野生种群也因此受到了威胁，许多种类都已经成为濒危物种[1]。

性别是鹦鹉最重要的特征之一，雌雄个体的鹦鹉通常在其生理、行为等方面都具有不同之处。而鹦鹉的性别鉴定，特别是早期的性别鉴定对它们的饲养管理、繁殖与育种、遗传疾病防治、种群结构和群体遗传分析等方面都具有非常重要的意义，特别是对已经处于濒危边缘鹦鹉的保护和管理具有重要作用[2]。鹦鹉性别鉴定常见的方法主要分为3类，即形态学鉴定法、细胞生物学鉴定法和分子生物学鉴定法[3-5]。

1 鹦鹉性别鉴定的形态学方法

1.1 行为判定法

鸟类行为学一般是指研究鸟类行为特征以及表现出某种行为的原因的一门学科，侧重于描述行为以及对行为机理的探索[6-7]。应用该种方法对虎皮鹦鹉进行观察发现，雄性鹦鹉一般会喂食给另外一只成年鹦鹉，而雌性鹦鹉只会喂养幼鸟；雌性鹦鹉相对于雄性鹦鹉更容易用喙啄人。但是仅凭这些特征并不能完全确定一只鹦鹉的性别。

1.2 翻肛判定法

翻肛法就是通过观察鹦鹉的泄殖腔而对其性别做出鉴定的方法。该种方法通过观察1日龄幼鸟的泄殖腔内是否具有待发育的雄鸟生殖器从而确定其性别。经验丰富的人员能达到95%的鉴别准确率，而非专业人员最多只能达到60%～70%的准确率[8]。

1.3 外科手术判定法

外科手术判定法一般是指通过腹腔镜检对鹦鹉性别做出鉴定，是一种直接对鹦鹉的生殖系统进行观察的鉴别方法。与亚成体（动物幼体经过变态后外形与成体完全相似但性腺尚未成熟的发育阶段）相比，成鸟的性腺组织更容易成像。在成像过程中，亚成体雄鸟的睾丸小而且表面无血管分布，而性成熟雄鸟的睾丸表面分布有血管，体积更大并且因季节不同大小存在差异。亚成体雌鸟的卵巢通常具有颗粒状的表面，而性成熟雌鸟卵泡则呈现出葡萄簇状。腹腔镜检法的主要缺点是需要对鹦鹉个体进行麻醉，鉴定过程存在对重要器官造成伤害的风险，甚至危及鹦鹉的生命[8]。

1.4 排泄物类固醇判定法

该种方法是基于鹦鹉排泄物中存在的雌二醇与睾酮的相对水平（E/T）来进行性别判断。雌鸟排泄物中的E/T比雄鸟高。但是在进行该种方法检验时，要求所分析的排泄物试样必须是新鲜的。繁殖与非繁殖季节以及年龄等因素之间的交互作用在很大程度上影响着鹦鹉排泄物中的激素比例，甚至会对鉴别结果产生干扰，并且由于激素在卵中和发育的胚胎中为非均匀分布，因此，取样方法是至关重要的。鉴于上述因素，该种方法适用于处在繁殖季节的成鸟。从方法和技术层面来看，鹦鹉排泄物中激素测定的准确性和特异性尚存在不稳定性，需要更多的试验加以验证。

1.5 叫声判定法

鹦鹉属于鸣禽类，而鸣禽在鸣啭行为上表现出明显的性别以及个体差异。通常雄鸟善于鸣啭，而雌鸟则很少或几乎不鸣啭。近年来，国内外研究表明鸟类复杂的发声行为与体内的性激素有着密切关系[9]，同时，与控制发声学习的神经核团的发育和成熟也存在相关性[10]。成年鸣禽的发声控制神经核团存在性别差异，因此，造成雌雄发声行为存在区别[11-13]。

1.6 体尺测量法

该种方法是指对鹦鹉的外形大小、个体高矮、头额宽度、翅膀和尾巴长度等参数进行测量比较来鉴定性别[14]。雄性鹦鹉个体头部略大、近似圆形，体重略重于雌性鹦鹉；而雌性鹦鹉头部略呈扁圆形。该方法虽然操作简单，但是准确性不高。

1.7 羽色伴性遗传法

该方法是指依据雌雄鹦鹉个体外表不同的羽毛颜色作为性别鉴定的方式，是一种非常直观的性别鉴定方法，操作简单且方便，但前提是必须要有羽色性连锁基因存在于待鉴定的鹦鹉种系基因之中。在该种鉴定方法中，应按照设计的杂交程序，选择出具有羽色性连锁基因的纯合系后代。该种方法的缺点是并非所有种系的鹦鹉都适用[15]。

1.8 其他形态学鉴定方法

以虎皮鹦鹉为例，成年雄性鹦鹉鼻孔区域的蜡膜通常为深蓝色或紫色，并且质地比较光滑；成年雌性鹦鹉的蜡膜通常为肉色、粉红色或褐色，并且质地较硬。但是，非成年鹦鹉或者出现基因突变的鹦鹉则无法进行判断。

在以上的鹦鹉形态学性别鉴定方法中都存在缺点，有些方法消耗时间，有些方法操作复杂，有些方法直接对鹦鹉本身产生较大的伤害，还有的方法判断正确率很低，并且需要专业的技术人员进行操作，这对于处于濒危状态的珍稀鸟类来说并不适合[3-5]。

2 鹦鹉性别鉴定的细胞生物学方法

鹦鹉的性染色体中，雌性鹦鹉为异配性别，由Z和W染色体共同组成，而雄性是同配性别，拥有2个Z染色体，这与大多数哺乳动物的性染色体配对方式相反。在对鹦鹉的性别染色体进行分离和核型分析后发现，染色体主要来源于新生羽毛中的细胞以及血液细胞的培养物之中，而且鹦鹉的大多数染色体均属于小染色体。也就是说，要保证染色体的数目分辨正确率是很难做到的。利用性染色体对鹦鹉进行性别鉴定是可行的，有研究表明，异配性别雌鸟的W性染色体与其他的小染色体差别较大，而较大的Z染色体与较小的W染色体是易于区分的[6]。但是核型分析法的缺点是培养获得可用细胞有难度并且操作过程比较费时。

3 鹦鹉性别鉴定的分子生物学方法

随着科学技术的不断进步，分子生物学方法已经成为一种重要的鹦鹉性别鉴定方法。大部分的分子生物学性别鉴定方法均是以聚合酶链式反应（PCR）为基础的。染色体的本质是DNA，因而后者可以作为鹦鹉性别鉴定可信度极高的物质基础。血液和羽毛可用作提取DNA的样本来源。利用从羽毛中提取出的DNA对鹦鹉进行性别鉴定，被称为组织性别鉴定法。但是DNA只能在羽毛轴端提取，因而该种方法存在一定的操作难度。一般来讲，用3～5根新拔的腹羽就足够提供试验所需的样本量，此外，羽毛还可以在分析处理之前冷冻保存；而且运用羽毛进行DNA的提取能够降低应激反应，避免对鹦鹉造成过度伤害。研究人员依据核DNA含量的不同，采用流式细胞分析法实现了3种不同鹦鹉的性别鉴定，即亚马孙鹦鹉、虎皮鹦鹉和鸡尾鹦鹉[6]。利用羽毛样本进行DNA分析，可以在早期对鹦鹉的性别做出鉴定，并且对鹦鹉个体的伤害较小。

3.1 随机扩增多态性DNA

利用随机扩增多态引物扩增获得的DNA片段可用来进行性别鉴定。如果选择的随机扩增引物位于W染色体上，扩增产物只能在雌性鹦鹉中获得，该位点即可成为雌鸟的特异性标记[8]。但是，随机扩增多态性DNA本身具有一些缺点，包括扩增条件的敏感性导致重复性差，低效率扩增和不同片段扩增竞争导致出现更多非特异条带等问题。

3.2 微卫星

研究表明，基因组中含有许多短的衔接重复序列。当这些短的重复序列的重复单位是2～4个碱基对时，则称为短串连重复序列或微卫星[6]。但是，利用该种方法进行性别鉴定时，由某些原因造成的PCR扩增失败会导致将雌鸟判断为雄鸟。研究发现，通过使用放射性标记引物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，能够减少该种误判[8]。

3.3 小卫星

小卫星又被称为数目可变串联重复位点。有研究表明，在利用人的小卫星探针33.15对南美13个属中的33个种的鹦鹉进行性别鉴定时发现，该探针在金刚鹦鹉种和锥尾鹦鹉种的性别鉴定上很有意义，但是该方法对一些短尾鹦鹉种和长宽尾鹦鹉种则不可用[6]。

3.4 CHD1基因

有研究表明，鹦鹉的CHD基因位于性染色体上，其在鹦鹉中有2个同源拷贝，即CHD-W和CHD-Z。其中，CHD-W为W连锁，CHD-Z为Z连锁[16-17]。 1995 年，Griffith 和 Tiwari[18]首次发现了与W染色体连锁的CHD-W基因，全称为染色体螺旋蛋白基因 （chromobox helicase-DNA binding gene）。随后的试验表明，该基因非常保守，几乎所有的非平胸类鸟类都含有CHD-W基因[19]，因而该基因开始被用于鸟类性别鉴定中。

运用CHD基因做出性别鉴定的方法主要通过2个途径实现。第1个途径是运用特异性引物对Z和W 2个染色体的特异性序列进行PCR扩增，再运用限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切。因为CHD-W基因上有特异性酶切位点，所以在对酶切产物进行电泳时，雌性会产生3条带，而雄性则为1条带。第2个途径是直接运用特异性引物对Z和W 2个染色体上不同大小的特异性序列进行PCR扩增，其检测结果显示为：雌性产生2条带，雄性产生 1 条带[20]。

研究表明，已经筛选出一些能够对CHD基因中内含子长度进行测定的引物。其中，最普遍的引物为P2-P8引物对和1237L-1237H引物对[21]。根据相关学者的报道，利用P2-P8引物对可以对金刚鹦鹉科进行性别鉴定[6]，并且准确率较高。还有研究通过使用P2-P8引物对来对鸡尾鹦鹉进行性别鉴定[22]。因为雌性是异配性别，雄性是同配性别，因此，经过5%琼脂糖凝胶电泳后，产生2条带的为雌性，而只有1条带的为雄性。

4 展望

有研究显示，雌雄鸟类自身所分泌的雌雄激素在体内的含量不同，而雌雄激素的含量水平是决定鸟类性别的关键因素。由雄鸟睾丸所分泌的雄性激素和由雌鸟卵巢所分泌的雌性激素可以激发并维持雄雌鸟的第二性征。有试验表明，割除或者移植公鸡与母鸡的生殖腺，会产生性别逆转的现象，也就是原来的母鸡逐渐产生了公鸡的外表特征和行为特征，例如长出了公鸡型的鸡冠和色彩鲜明的长尾羽毛等，而原来的公鸡也逐渐产生了母鸡的外表特征和行为特征。在该基础之上，首先通过鉴别已知性别鹦鹉体内的雌雄激素水平及比例，确定雌雄鹦鹉的激素分界水平，然后利用体内激素水平的含量数值，进而确定未知鹦鹉的性别，以达到鉴别鹦鹉性别的目的。

5 结语

综上所述，在实际工作中，具体采用何种方法对鹦鹉的性别进行鉴定，主要取决于操作条件、实验室的设备以及技术人员的经验。一般来讲，应用PCR方法进行鹦鹉性别鉴定具有以下优点：采样量小（1根羽毛），对鹦鹉造成的应激较小；利用稳定遗传的基因组DNA来进行性别鉴定，结果更可靠，同时对于刚出生的雏鸟也同样适用[23]；可以同时检测大量样品，高效快捷。目前，鹦鹉性别鉴定的分子生物学方法主要被科研机构和一些专门从事鸟类性别鉴定的商业公司应用，但是随着鹦鹉育种、濒危鹦鹉物种保护以及进化研究等方面的工作越来越受到重视，该种方法的应用范围必将逐渐扩大，并且会产生广阔的市场前景。而能否真正通过验证激素水平的方法达到鉴别鹦鹉性别的目的还有很多的工作要做。以上的思路和方法都以现今的科学技术手段作为支持，但能否基于这些技术开发新的鹦鹉性别鉴定方法，还需要广大研究人员进一步探索。