婴幼儿肠道病毒组学研究进展

史以超，彭丽华，杨云生

解放军总医院 消化科，北京 100853

人类肠道中栖息着细菌、真菌、病毒以及原生生物群落，这些微生物和宿主共同组成复杂的肠道微生态系统，影响着人类健康[1]。肠道病毒对人体健康的影响，主要通过肠道病毒间的相互作用、肠道病毒与宿主以及其他细菌间的相互作用决定的[2]。最近的研究表明，健康婴幼儿的肠道在不同发育阶段有着不同的病毒组。此外，在婴幼儿发育过程中，诸多因素如分娩方式、饮食、环境等均可影响肠道病毒组的组成[3]。本文针对当前婴幼儿的肠道病毒组学研究进展、婴幼儿肠道病毒定植的影响因素及婴幼儿肠道病毒组的功能等相关研究进行综述。

1 婴幼儿肠道病毒组

肠道病毒组学是指肠道中的真核RNA病毒、DNA病毒及噬菌体组成的复杂群落与宿主相互作用的总和[4-5]。一个多世纪前，病毒作为人类肠道内病原微生物已经渐渐被人们所熟知，如引起婴幼儿腹泻的病毒-轮状病毒、诺如病毒、肠腺病毒、星状病毒等[6-8]。这些病毒微粒能够被早期发现是由于这些病毒能够在体外培养。由于病毒具有整合功能，宿主基因组中常有很多病毒来源的遗传物质[9]，如真核生物基因组中的逆转录病毒元件、细菌基因组中的前噬菌体。目前研究表明，除了整合到染色体的病毒外，每个健康个体终其一生，可能有多种慢性病毒感染，包括疱疹病毒、多瘤病毒、腺病毒、乳头瘤病毒和指环病毒[10]。此外，其他病毒如肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒等也时刻威胁个体健康。

随着测序技术的发展，病毒的检测不再单纯依赖传统的分离培养技术，通过第二代高通量测序技术、第三代单分子测序技术可以直接将特定环境中的所有病毒遗传物质进行快速鉴定[11]。病毒组学分析过程主要包括病毒的分离纯化、病毒基因组提取、病毒基因组测序、注释及鉴定等[12]。早在2002年，Brcitbart等[13]采用鸟枪测序法首次检测了海洋生境中的病毒群落，结果发现海洋的病毒群落中富集噬菌体病毒。随后，进一步对人体粪便的病毒群落进行测序，结果表明健康个体的粪便中含有约1 200种病毒，其中以噬菌体为主(长尾噬菌体科为优势病毒科)[14]。这些研究掀起了病毒组学研究的序幕。然而即便如此，人体标本采用宏基因组测序分析发现，与人体相关的病毒样颗粒的数目和类型都被低估了。宏基因测序相关的病毒样颗粒仅有14% ～87%能够分类，这表明仍有大量的未知病毒定植在人体中[15]。

人体肠道微生物的形成始于婴儿出生，并在2 ～ 3岁时逐渐形成类似于成人肠道微生物组的组成结构。在这段时间内，真核病毒及细菌组不断扩张，同时噬菌体组不断收缩[16]。在生命的初期阶段，病毒群落组成变化剧烈，这种婴儿时期肠道病毒组的不稳定性与婴儿肠道微生物组构成的快速变化相一致[17-18]。

Breitbart等[17]收集健康足月顺产并混合喂养新生儿的新鲜粪便，提取纯化粪便病毒总DNA。结果表明，新生儿第1周的粪便病毒多样性较低，其中约66%的测序序列在GenBank非冗余数据库比对不上，说明大部分粪便的病毒可能是新型病毒[17]。可识别的双链DNA序列为噬菌体病毒，包括Podoviruses、Siphoviruses和Myoviruses等，以Siphoviruses和前噬菌体病毒为主。此后，将第1周和第2周的粪便病毒DNA样本，与以第1周病毒序列为模板构建的微阵列探针杂交[17]。结果发现1 ～ 2周龄发育过程中，病毒组群落组成发生了剧烈变化，超过半数在第1周出现的病毒种类在第2周检测不到。

Reyes等[19]采集美国密苏里州的4对同卵双胞胎和母亲的粪便进行病毒组学研究。分别收集在研究开始时、出生后2个月及1年的粪便样本，抽提病毒DNA后采用多重鸟枪454焦磷酸测序法进行全基因组扩增测序，与自定义的非冗余病毒数据库(NR_Viral_DB)比对分析，结果发现81%±6%的测序序列不能匹配已知的病毒，而比对到的病毒主要是前噬菌体和温和噬菌体(如大肠埃希菌噬菌体P22)。进一步采用α及β多样性分析发现，尽管双胞胎之间具有高度的遗传关联度，但他们个体的病毒组具有相对独特性[19]。个体内部的病毒多样性非常低，＞95%的病毒类型在随访期间能够保持，并且几个少数的优势温和噬菌体病毒具有显著的遗传稳定性。

Lim等[16]收集美国圣路易斯州的4对顺产、母乳喂养的双胞胎婴儿的粪便，分别采集出生1 ～ 4 d、3个月、6个月、18个月及24个月的粪便提取总DNA。为了全面检测DNA和RNA病毒，粪便样本中提取的总核酸采用多重置换扩增法(MDA)和序列依赖的DNA和RNA扩增法(SIA)。经过文库的构建后，Illumina MiSeq平台进行测序。所测得的病毒序列比对定制的病毒数据库(公开数据库NCBI NT和NR下载优化)。结果表明，相比于真核RNA和真核DNA病毒，婴幼儿粪便中更富集噬菌体家族。此外，婴幼儿粪便标本中，可以检出真核RNA病毒如杯状病毒、星状病毒和小核糖核酸病毒；仅发现一个古细菌病毒家族(lipothrixviridae)。从出生到2岁，真核生物病毒组和细菌组微生物逐渐扩张，但是这一过程也伴随着噬菌体病毒组组成萎缩及移位。在新生儿粪便中，他们发现相对于真核RNA和DNA病毒，噬菌体病毒组占有绝对优势，以有尾噬菌体目和微病毒科为主。而新生儿粪便样本中真核病毒的丰度较低，随后逐渐扩张。最常检出的真核RNA病毒为Pnterovirus、Parechovirus、Tombamovirus和Sapovirus；真核DNA病毒Anelloviruses科占有优势。与真核病毒变化相反，噬菌体在刚出生时丰度最高，随着年龄增长而下降。最常见的噬菌体是Caudovirales目(Siphoviridae、Inoviridae、Myoviridae和Podoviridae科)和Microviridae科。

2 婴幼儿肠道病毒定植的影响因素

2.1 孕期及分娩 既往研究表明，许多致病性真核病毒如巨细胞病毒、流感病毒、风疹病毒、水痘病毒、人乳头状病毒及艾滋病病毒等，均可以通过胎盘或者产道传染新生儿[20]。这些病毒感染，可能无明显症状到导致流产。针对性的羊水PCR检测多种病毒，如腺病毒、巨细胞病毒、呼吸道合胞病毒、肠病毒、EB病毒和微小病毒B19等[21]。但这些可检测到的真核病毒对胎儿生长发育的临床意义尚未可知。子宫羊水的病毒宏基因组学测序可能对胎儿的健康起重要提示作用。此外，不同的分娩方式的差异，可能会导致新生儿胎便病毒的不同。相较于顺产新生儿胎便，剖宫产的新生儿胎便中富含铜绿假单胞菌噬菌体[22]。McCann等[23]采集科克大学产科医院2012年2月- 2014年5月的10例顺产及10例急诊剖宫产婴儿1岁时粪便进行病毒组学测序研究。结果显示，阴道分娩和剖宫产影响婴儿的病毒组组成。阴道分娩的婴儿肠道具有更多的病毒与噬菌体多样性。提示病毒从母体到儿童的垂直传播可能在塑造早期生命微生物群中起作用，并且在研究生命早期的肠道病毒时应考虑出生方式[23]。

2.2 母乳及饮食 母乳中的双歧杆菌群落及噬菌体可以通过母乳的垂直传播稳定地传递给新生儿[24-25]。此外，母乳也能分泌一些病毒，如人类免疫缺陷病毒1型和2型、人类T淋巴细胞白血病病毒、巨细胞病毒、肝炎ABC病毒、单纯疱疹病毒1型和2型、水痘-带状疱疹病毒等，可能增加婴幼儿感染的风险。此外，采用饮食干预研究人类肠道病毒的动态变化过程表明，肠道病毒组变异的主要是因为个体之间的差异，但是病毒种群的显著变化和转换与确定的饮食有明显的相关性，并且对于类似饮食的个体，可以观察到病毒种群的趋同性[26]。

2.3 地理环境 婴幼儿肠道病毒组的发育成熟离不开环境因素的塑造。Ly等[27]研究群体的口腔及肠道病毒生态发现，大量的肠道与口腔病毒(大部分是噬菌体)在遗传不相关的同居个体之间共享；并随时间推移，噬菌体在家庭内的分布表明它们在家庭接触的微生物群之间传播[27]。一项研究比较了87例分别来自墨尔本和澳大利亚北部地区的儿童腹泻队列中的真核病毒[28]。来自澳大利亚北方地区的儿童腹泻样本较墨尔本的腹泻样本含有更多的病毒家族，这些病毒包括腺病毒、小RNA病毒科(肠病毒属)。不同的饮食、居住条件、水质环境因素、卫生和(或)社会经济地位可能在肠道病毒的组成中发挥重要作用[28]。

2.4 个体差异 目前的研究表明，肠道病毒存在着高度的个体特异性。在一项研究中，研究者在1年中的3个时间点对成人同卵双胞胎及其母亲的粪便样品进行研究[19]。研究结果表明，家庭成员间的肠道微生物组具有更高的相似性，暗示了环境暴露在人体肠道微生物群落形成过程中的重要作用；同时，研究显示双胞胎与其母亲间的病毒组差异远远大于相应的细菌组差异，表明个体之间的病毒组存在明显的差异[19]。尽管个体之间的病毒组差异明显，成人个体内部的病毒组的纵向变化却很小，肠道病毒在个体间变异性也是有限的。在婴幼儿期，肠道病毒在双胞胎个体间的相似性较非相关婴儿更高。双胞胎可以将接种轮状病毒疫苗的婴儿传播到未接种疫苗的婴儿，提示密切接触可能是病毒间传播的驱动力。

3 婴幼儿肠道病毒组的功能

肠道微生物群落对宿主的生长、发育及健康维持具有十分重要的作用。肠道病毒组可以直接或间接调控婴幼儿免疫应答、微生物代谢与营养、黏膜保护等，从而对宿主产生影响[2,29-30]。

众所周知，噬菌体可以与细菌通过捕食-被捕食的关系改变细菌微生物组成结构。研究表明，通过传统的捕食-被捕食模型进行预测发现，被捕食者(细菌)的波动一般在捕食者(噬菌体)波动之前发生。然而，在婴幼儿早期发育过程中噬菌体-细菌相互作用却从相反的动态过程开始。早期的细菌定植与噬菌体病毒群落的收缩相关，但是仍然符合捕食-被捕食模型的动力学特征[31]。这些结果提示我们噬菌体有可能对新生儿肠道微生态环境起着保护作用，这样可以通过噬菌体选择抑制异常细菌定植并保留益生菌定植。

婴幼儿早期的肠道病毒定植可能有助于免疫系统的发育，从而抵抗随后的感染并阻止过度免疫反应。既往研究表明，胃肠道的真核病毒如Murine Norovirus感染无菌或者抗生素治疗的小鼠，能够抵消抗生素对肠道损伤作用并防止致病细菌感染，恢复肠道表层细胞数量及功能，可以部分代替肠道菌群的功能，并且还有助于恢复肠道免疫系统功能[32]。此外，有研究显示噬菌体在黏液中富集是通过噬菌体衣壳上暴露的Ig样蛋白结构域与黏蛋白糖蛋白的结合相互作用发生，保护宿主上皮细胞免受细菌感染[33]。噬菌体和宿主之间的共生关系，能够主动保护黏膜表面，提供了新的抗微生物防御机制[33]。噬菌体的基因可以通过水平转移到宿主细菌，从而对婴幼儿健康产生影响。肠道噬菌体基因编码厌氧核苷酸合成、细胞壁合成和降解，毒力因子相关基因、糖类代谢利用基因、耐药基因等相关的基因，可以通过基因的水平转移使噬菌体基因组进入宿主细菌中，对宿主细菌在肠道中的稳态维持起重要作用[19]。

4 结语

随着肠道微生态组学研究的不断深入，人们已经认识到肠道微生态在婴幼儿发育、成长中的重要作用。但针对婴幼儿肠道病毒组的研究尚不深入，病毒组数据库还不完善，病毒组的作用尚不十分明确。在未来的研究中，需结合高通量测序和生物信息学的方法全面解析婴幼儿肠道病毒组的种群及数量，深入探讨肠道病毒组与其他微生物(如细菌、真菌)种群间的相关关系。进一步明确婴幼儿肠道病毒组在健康中的作用。