外泌体在再生修复及抗衰老领域的研究进展

韩愚弟，白 云，任 静，韩 岩

解放军总医院 整形修复科，北京 100853

近年来研究表明，干细胞所发挥的作用在很大程度上是由其强大的旁分泌功能而实现的，而不是其在特定部位的增殖和分化[1]。1986年，Eberhard和Johnstone首次在体外培养的绵羊红细胞上清中发现了一种有膜结构的小囊泡，将其命名为外泌体(exosome)。随后的10年，外泌体被认为是细胞代谢过程中产生的“排泄物”，并未受到重视。直到20世纪90年代，外泌体膜被发现可以携带Ⅰ型和Ⅱ型主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)抗原提呈分子(MHC-Ⅰ，MHC-Ⅱ)，参与淋巴细胞免疫[2]。21世纪初，Lotvall发现细胞之间可以通过外泌体中的RNA交换遗传物质，人们逐渐意识到到外泌体可能存在重要生理功能[3]。近些年的研究发现，外泌体可能作为细胞与细胞之间的通讯工具而参与了旁分泌作用，并被发现在多种病理生理过程及疾病进程中发挥重要作用，遂逐渐成为肿瘤免疫领域以及再生医学领域研究的热点[4-5]。本文将对外泌体的形成、作用机制以及间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)来源外泌体在再生修复和抗衰老方面的作用以及未来研究方向做一综述[6]。

1 外泌体的特点及其作用机制

外泌体(exosomes)是一种由细胞分泌的直径为40 ～150 nm、密度范围为1.09 ～ 1.18 g/ml的具有双层磷脂膜结构的囊泡样物质。目前已经从各物种、各类型的细胞培养上清中提取出了外泌体，如神经元细胞、间充质干细胞、成纤维细胞、内皮细胞、巨核细胞等。外泌体也被发现存在于人体的各类体液中，如血液、唾液、尿液、乳汁等[7]。存在于细胞培养上清及各种体液中的囊泡并不完全相同，已有的研究显示其大致分为三个亚群：直径最小的为外泌体，以及微囊泡(microvesicles)和凋亡小体(apoptotic bodies)，后两者的直径均＞200 nm，且产生的机制与外泌体不同[8]。

现有研究认为，不同类型细胞外泌体的产生大同小异[9]。首先，内质网系统或细胞膜通过内吞形成早期内体(early endosomes)，经胞内运输演变为晚期内体(late endosomes)，随着某些病理生理过程的进行，一些“货物”(miRNA，热休克蛋白，细胞因子等)被携带进入。晚期内体内部产生许多小囊泡(intraluminal vesicles，ILVs)，最后形成具有蛋白运输与分拣中心功能的多囊泡体(multivesicular body，MVB)。随后，这些小囊泡会被释放到胞外，形成外泌体。此过程需要内体运输分拣复合物(endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)和液泡蛋白分选因子(vacuolar protein sorting 4，Vps4)的协助。被释放入体液的外泌体，随着循环系统到达其他组织或器官，作用于其他靶细胞。不同来源的外泌体会通过3种机制和内吞作用进入受体细胞：1)外泌体进入受体细胞后，将“货物”释放进入胞质内，并重新形成多泡体；2)外泌体将“货物”释放进入胞质，自身与细胞膜融合；3)外泌体上膜表面配体与靶细胞膜特殊受体结合，同时起到信号传导以及将“货物”运入胞内的作用。外泌体具体组成成分与其母细胞有关，但整体较保守，一般都含有下列物质：四跨膜蛋白(CD9、CD81、CD63)、热休克蛋白(HSP70、HSP90)、MHCⅠ类和(或)Ⅱ类分子、整合素、细胞骨架蛋白(TSG101、ALIX)等[3,10]。这些分子与外泌体的生物学功能密不可分，同时也可以作为鉴定外泌体的标记物。因细胞内部囊泡(外泌体等)合成运输调控机制的重要发现，美国科学家Rothman、Schekmam，以及德国科学家Sudhof联合获得了2013年的诺贝尔生理学与医学奖，他们的发现使外泌体的研究到达了全新的高度。

2 外泌体在组织损伤修复和再生医学中的作用

近年来大量文献报道了外泌体在心肌缺血再灌注损伤及心肌梗死修复方面发挥重要作用[1,11]。2015年，心血管领域权威杂志Circulation Research首次证实胚胎干细胞在心梗中的治疗作用[12]。该研究发现，小鼠心梗造模成功后在心梗边缘区注射外泌体，4周后心脏超声、心梗面积等各项指标均明显改善。组织病理切片证实外泌体同样促进了血管新生(毛细血管密度)和心肌细胞增殖。此外，基因芯片证实外泌体中携带的miRNA290在促进心肌前体细胞的存活及增殖方面起到重要作用。除了干细胞外泌体，内源性血浆外泌体也可为心脏提供保护作用。英国伦敦大学的研究者证实，大鼠心梗模型中，术前尾静脉注射血浆外泌体，心肌梗死面积可以从48%降至25%[13]。该研究进一步证明，外泌体通过其膜表面上的热休克蛋白HSP70结合受体细胞膜表面的toll样受体4，从而靶向介导了心肌保护的功能。在肌肉重塑和修复过程中，肌肉干细胞(卫星细胞)和骨骼肌中的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)之间的相互作用至关重要。卫星细胞激活后可以在ECM内产生肌源性祖细胞(myogenic progenitor cells，MPCs)，反过来ECM在过度沉积和老化期间也影响卫星细胞的活性。美国肯塔基大学的科学家发现，MPCs分泌携带miR-206的外泌体，可抑制成纤维细胞中胶原合成的主要调节剂Rrbp1，以防止ECM的过度沉积。揭示了骨骼干/祖细胞与其他类型细胞相互作用以调节外环境稳态、维持自适应[14]。

各种原因造成的难愈性创面和瘢痕形成是软组织修复面临的棘手问题。近年研究证实，间充质干细胞外泌体，包括iPS诱导的间充质干细胞、脐带干细胞、脂肪干细胞，都具有促进动物模型创面愈合的能力[15-16]。这些功能主要依赖外泌体携带的microRNAs，如miR31、miR125a，作为刺激信号，促进了内皮细胞的迁移、增殖和血管生成[17-19]。同时还发现外泌体在皮肤缺损小鼠模型中，可减少瘢痕形成和肌成纤维细胞的增殖。高通量测序和功能分析证明，外泌体携带的miR-21、miR-23a、miR-125b和miR-145抑制了TGF-β2/SMAD2信号通路，从而抑制肌成纤维细胞的形成，进而阻止了瘢痕形成[20]。

在骨组织修复方面，外泌体也可以单独或与其他生物材料联合应用，起到修复骨及软骨缺损的作用[21]。研究发现人诱导多能干细胞分泌的外泌体，能有效促进雌激素去势骨质疏松大鼠模型中，骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化[22]。在此基础之上发现诱导多能干细胞外泌体+β-磷酸三钙支架的组合，较单纯β-磷酸三钙支架具有更好的骨缺损修复作用[23]。关节软骨的乏再生能力是运动医学治疗中的巨大挑战。上海交大附属第六人民医院与华东理工大学的科研工作者合作研发了一种光敏水凝胶，液体状态时可以复合干细胞外泌体，光照后变成凝胶状，填充在软骨缺损部位充当外泌体载体以及软骨再生的支架材料，促进细胞沉积在软骨缺损部位，最终促进软骨缺损修复[24]。其优点为易于操作，具有极好的生物相容性。更有研究发现，关节腔滑膜间充质干细胞来源的外泌体也可以增强软骨细胞的增殖和迁移，促进软骨组织的再生能力[25]。

3 外泌体与抗衰老

有研究表明，小鼠下丘脑神经干细胞(hypothalamic neural stem cell，htNSC)的损耗，导致小鼠出现了衰老的症状以及生命周期缩短。向衰老小鼠脑室注射神经干细胞外泌体可以延缓脑衰老速度，延长小鼠寿命[26]。研究还显示，外泌体携带的miRNA能够部分调节htNSC的抗老化效应，并在htNSC进入脑脊髓液后发挥相应作用。在皮肤抗衰老方面，韩国的Kim等[27]研究发现，脐带间充质干细胞来源的外泌体可以轻易穿透角质层到达真皮，促进人皮肤组织Ⅰ型胶原和弹力蛋白的生成，改善皮肤质地。这些研究表明外泌体具有抗衰老应用前景。

在早期发现机体衰老迹象方面，外泌体也有其临床应用价值。唾液里有很多分子物质和微生物，可以作为局部或全身的有效生物指标，血液来源的分子会通过跨细胞或细胞旁路进入唾液腺进而影响唾液的组成成分。日本冈山大学研究人员推测唾液外泌体的miRNA可作为衰老的生物标记物[28]。有研究对青年人群和老年人群的唾液外泌体进行miRNA的筛选和验证，发现miR-24-3p的表达有显著差异，从而认为miR-24-3p是一个新的衰老相关的生物标记物。此结果表明，唾液外泌体检测有希望作为一种标记衰老的手段。

4 展望

除了上述特点与功能，外泌体作为一种天然的脂质体，还是一种比较理想的药物载体，凭借归巢能力，可被靶细胞特异性吸收[29]。外泌体还能进行膜修饰从而增强细胞特异性靶向作用。安德森癌症中心Kalluri的最新成果显示，修饰过后的外泌体可以递送iRNA，用于胰腺癌的治疗[30]。实验对外泌体进行基因修饰(命名为iExosome)，装载靶向胰腺癌细胞KRAS突变基因的RNA干扰药物，结果表明iExosome比同样经过修饰的脂质iLiposome递送效果更好，能够抑制侵袭性胰腺癌生长。这得益于外泌体表面的CD47，它能够阻止外泌体在血液循环系统中被单核细胞清除。这项研究的结果表明，外泌体具有足够时长的循环半衰期和免疫逃逸能力，且能够加载多种不同的药物，是一种很有应用前景的药物治疗新工具。