二次谐波成像技术在腱病动物实验研究中的应用综述

胡 波，薛 曼，李春宝，高 奉,，张 贞，申学振，张柏青，刘雨丰，鹿 鸣，刘玉杰解放军总医院 骨科，北京 008；北京朝阳中西医结合急诊抢救中心 骨二科，北京 000；中国科学院化学研究所分子科学国家研究中心，北京 0090；中国科学院大学，北京 0009；国家体育总局运动医学研究所，北京 0006

二次谐波是一种非线性光学效应，区别于光的反射、折射、衍射、干涉等线性光学效应。这种非线性光学效应是在激光问世之后才被科学家们发现并开始研究的。1961年，Franken等[1]发现当激光器发射波长为694.3 nm的红外激光穿过石英晶体时，除了红外激光透射过晶体外，还能产生另一个波长为347.15 nm的紫外激光。Franken激光倍频实验首次实现了二次谐波(second harmonic generation)现象。在二次谐波的产生过程中，当激光强光照射到分子有序排列的石英晶体上，光波不再遵守线性叠加原理，而是与介质发生相互作用，产生了非线性光学效应[2]。从此，关于非线性光学的研究迅速发展起来。经过半个多世纪的发展，二次谐波技术实现了巨大的飞跃，特别是二次谐波成像技术，由于其独特的高对比度、高分辨率等成像特点，已经被迅速应用到生物医学研究领域，拥有巨大的应用前景。

1 谐波成像的条件与特点

一般认为，二次谐波信号的产生必须满足三个条件：1)入射光强度必须足够大，所以在激光诞生后才观察到了二次谐波现象；2)介质满足相位匹配原则；3)介质中具有非中心对称结构。由于在生物组织中，胶原、微丝、微管、细胞膜脂质双分子层等结构都具有很好的二阶非线性极化率和结构非中心对称性，因此能够产生很强的二次谐波信号[3-5]。不仅如此，二次谐波成像还具有如下特点：1)二次谐波是生物组织的原发性信号，样品无需染料标记，成像过程中没有能量吸收，从根本上消除了对样品的光致毒问题，成为一种非侵入性的成像方法，这与双光子荧光成像有本质的区别[3-4,6]；2)使用近红外的激发光，在样品中的穿透能力强，对样品的损伤小，因此可以观察比较厚的样品，获得深层次的成像；3)二次谐波成像的入射光波长与激发光波长相距较远，信号不易互相干扰，提高了信噪比；4)在观察较厚的组织标本时，二次谐波成像减少了非焦平面杂散光所产生的背景干扰，提高了三维空间分辨率，并进一步提高了信噪比[2-3,7-8]；5)由于没有能量吸收过程，因此即使在焦平面上也没有光毒性和光漂白性，这点也是区别于双光子显微镜成像的最大优势[3,6]；6)二次谐波的产生是材料的二阶非线性极化率所引起的，因此其信号可反映组织材料的某些结构特性[9]；7)二次谐波对材料的结构对称性变化比较敏感，可为某些疾病的诊断和治疗提供依据。正是基于以上特点，二次谐波成像技术在生物医学领域的应用得以发展。

2 二次谐波成像技术在肌腱病研究中的应用

在生物组织中，胶原、微丝、微管、细胞膜脂质双分子层等结构能产生较强的二次谐波信号。因此，理论上各种组织都有利用二次谐波成像技术进行观察的可能性。2010年，Olivier等[10]利用二次谐波成像和三次谐波成像，观察了斑马鱼胚胎的有丝分裂全过程，记录下斑马鱼受精卵从一个细胞到有丝分裂10次以后的二次谐波和三次谐波图像，包括最深部细胞的有丝分裂纺锤体的形成和512个细胞阶段的整体细胞团簇立体图像，并记录了每一级分裂的时间，精确到分钟。这有力地证明了谐波成像技术的三维空间分辨率优势和无光毒性、光漂白性方面的安全性。2016年，Kuzmin等[11]利用背向二次谐波成像和三次谐波成像技术观察了低分化神经胶质瘤的大体病理标本，展示出肿瘤细胞与正常细胞在二次谐波成像下有更明显的界线。原因是二次谐波信号的产生与生物组织的结构特性有关，因此可以发现更早期的肿瘤细胞内蛋白分子结构上的细微变化，同时也充分证明了背向谐波成像观察活体、大体厚标本的优势。

肌腱组织主要成分是胶原纤维，肌腱病发病率很高。但是肌腱病的研究仍然有许多问题没有解决，包括病理、疼痛机制、病因，甚至连术语都没有得到统一[12-17]。因此肌腱组织也是二次谐波成像研究中的重要对象之一[18]。1971年Fine和Hansen[19]在胶原组织中首次检测到二次谐波信号。2011年，Abraham等[20]通过对照大鼠跟腱的二次谐波成像和双光子荧光成像，显示二次谐波成像拥有更高的图像分辨率和对比度。2012年，Abraham等[21]又分别利用前向、背向二次谐波成像技术对体外模拟环境下细胞外基质中Ⅰ型胶原的重塑进行了三维成像定量分析，其中包括SHG信号衰减、纤维直径、细胞尺寸、共定位轮廓、3D体积和傅立叶分析，证实了二次谐波信号与胶原结构的强相关性。2014年，Bancelin等[22]利用二次谐波成像技术观察鼠尾肌腱，并精确测得了其胶原纤维的直径最小可达30 nm，指出二次谐波成像的分辨率比普通光学成像高15倍。2015年，Wen等[23]利用反射棱镜使激光从两个相互垂直的方向照射标本，对鼠尾肌腱纤维进行激发并进行二次谐波成像，证实胶原纤维的蛋白分子平行、定向的排列方式，当入射激光方向与纤维排列方向平行或垂直时，会产生不同强度的二次谐波信号，这一点与其他通过染色或荧光蛋白标记后的成像方式都不同，包括双光子激发荧光显微镜。作者认为普通二次谐波成像的三维图像是靠计算机将多个焦平面的二维图像叠加重建出来的，不是真正的三维图像。而上述单一入射方向的激发光产生的二次谐波信号可能会因为入射激光方向与胶原排列方向垂直而无法产生较强的谐波信号，该现象容易导致判断细胞外基质中胶原蛋白的三维结构时丢失重要信息，通过双光子激发荧光显微镜进行对比验证，为探索二次谐波成像特点及参数设置提供了重要依据。孙娅楠等[24]利用背向二次谐波成像和双光子荧光成像技术观察了人源胶原蛋白涂抹于小鼠表皮层后的透皮吸收程度，发现二次谐波成像可以更快速、更灵敏地检测皮肤中的胶原纤维。Wu等[7]利用二次谐波成像三维空间高分辨率的特点，对跟腱的胶原纤维基质的三维结构进行了分析，明确了胶原纤维基质的横向、斜向连接对跟腱的生物力学的影响。2016年，Zhao等[25]设计了一个光纤探针，尝试将激发光源和谐波信号采集通过光纤进行传输，并用这种装置观察了树叶、鱼鳞和鼠尾肌腱。虽然这种技术距离临床应用还有很多问题，但将谐波成像技术从实验室向临床应用推进了一大步。Hase等[26]通过家兔肌腱离断愈合的动物模型进行二次谐波观察和力学测试，发现离断肌腱部位胶原排列杂乱，与正常肌腱呈现出不同的二次谐波成像信号。并提出了采用所有像素点二次谐波信号强度的平均值和傅立叶变换的方法来对二次谐波成像进行量化分析。这种二次谐波信号强度和傅立叶变换的方法曾于2010年被Fung等[27]采用，用来分析疲劳载荷下肌腱的形态学变化。Hase等[26]将大体标本的二次谐波成像与实时生物力学测试相结合，进一步展示了二次谐波成像无需切片、染色，在新鲜标本上即可进行检测的优势，提出了用光纤探针技术观测活体标本，以及二次谐波成像运用于临床的重要意义。但目前为止，在腱病动物模型的建立方面还缺少研究证据，需要进一步研究。

3 二次谐波成像技术的展望

谐波成像技术本身也在不断完善和改进，在普通二次谐波成像技术的基础上，衍生出了一系列新的成像技术，如快速干涉谐波成像[28-29]、调节偏振/消偏振二次谐波成像[9,30-31]等，均具有很大的发展潜力。但二次谐波成像仍需要对以下因素进行最优化考虑：1)脉冲激光器的输出功率及其稳定性；2)合适数值孔径物镜的选择；3)高灵敏度探测器的选择；4)不同脉冲激发波长的选择；5)观测样品的选择和制备方法(富含胶原、微丝、微管等具有高二阶非线性和准相位匹配的样本)[32]。总之，二次谐波成像技术仍是一个尚未普及的、具有较高技术的新型检测方法。该方法对样本的要求简单，但对仪器设备的操作、调试和维护要求非常专业。因此，二次谐波成像技术的发展和应用范围的进一步拓展，需要生物医学领域和物理化学领域更加紧密的合作。在腱病研究方面，高效、稳定的动物模型的建立仍是当务之急，动物实验控制上很难迫使所有的实验动物达到过度使用的最低标准。如何选择合适的模型动物及增加动物在运动过程中的依从性是自主运动建立过度使用性肌腱病动物模型的发展方向[33-35]。在此基础上，才能利用二次谐波成像对生物组织结构高度敏感的潜在优势，对腱病的发病机制做出深入研究，使其成为一种针对肌腱腱病的新型的、早期的、无创的诊断方法。