CRISPR/Cas9基因编辑系统研究进展

程 成，舒鹏程，彭小忠*

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 临床医学八年制； 2.中国医学科学院 基础医学研究所北京协和医学院 基础学院 生物化学与分子生物学系 医学分子生物学国家重点实验室； 中国医学科学院 医学灵长类研究中心 神经科学中心， 北京 100005)

近年来，CRISPR/Cas9基因编辑系统被广泛应用于生物学及医学各领域，包括基因表达与表观遗传学调控，遗传物质的动态可视化，模型动物的建立，基因疗法的探索等。在gRNA引导下，Cas9核酸酶靶向特定DNA序列并诱发DNA双链断裂(double strand break, DSB)。DSB可由两种内源性的修复机制修复，易于出错的非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)和同源重组介导的修复(homology-directed repair, HDR)，从而实现基因敲除、敲入和染色体转位等编辑[1]。

在CRISPR/Cas9用于基因编辑之前，已有大量研究表明锌指核酸酶(zinc finger nucleases, ZFNs)和转录激活样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)可靶向特异的DNA。它们均需依赖蛋白-DNA识别，因此每次实验都需要根据靶点构建不同的蛋白[2]。而依赖RNA-DNA识别的Cas9，仅需对gRNA进行设计，简化了操作流程，为其在生物学各领域的应用提供了技术条件。本综述将简要介绍CRISPR/Cas9介导的基因编辑原理以及近年来技术改进。

1 CRISPR/Cas9基因编辑原理

CRISPR/Cas系统来源于细菌和古细菌的适应性免疫系统，可监测并降解从噬菌体和质粒入侵的DNA[3]。该系统分为1、2两大类。其中，2类只需单一的效应蛋白，更易于进行体外设计和改造。效应蛋白为Cas9的Ⅱ型是2类系统中最早发现的，目前基因编辑中最常用的也是Ⅱ型的化脓性链球菌Cas9核酸酶 (streptococcuspyogenesCas9, SpCas9)。

当外源DNA入侵细菌时，Ⅱ型CRISPR系统首先将入侵DNA整合入CRISPR重复序列之间。随后，重复序列的转录本被加工为CRISPR RNA(crRNA)，每条crRNA都包含一段由入侵DNA转录而来的前间隔序列。接着，反式激活crRNA(transactivating CRISPR RNA, tracrRNA)与crRNA结合，介导其成熟，并与Cas9酶形成复合物。crRNA的前间隔序列与入侵DNA碱基配对，前提是入侵DNA中与crRNA序列相同的链在下游紧挨前间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif, PAM)。最后，Cas9依赖其HNH和RuvC样结构域在PAM上游3 nt的位点诱发入侵DNA的DSB。其中，HNH剪切与crRNA互补配对的DNA链，RuvC则剪切入侵DNA的另一条链[4]。

直至2013年研究者对该系统进行简化，首次将CRISPR/Cas9运用于真核细胞的高效基因编辑。研究中，tracrRNA: crRNA二重体被改造为单一的引导RNA (single guide RNA, sgRNA)，其5’端20 nt的序列通过碱基对互补来靶向DNA位点。Cas9在该位点诱导DSB，并由NHEJ或HDR介导无义突变或基因敲入[5]。

2 CRISPR/Cas9技术改进

CRISPR/Cas9在基因编辑上已有诸多应用，但在实际操作中，脱靶效应和编辑效率依然是影响其编辑效果的两大主要因素。目前已有诸多研究针对上述问题对该系统加以改进，以实现更可靠高效的编辑。其中主要进展如下。

2.1 降低脱靶率，提高靶向特异性

各类CRISPR/Cas9系统均可作用于目标位点以外的脱靶位点，产生DSB并引起插入缺失及转位，即脱靶效应。脱靶效应对目标位点的编辑效率及基因编辑过程的安全性具有不可忽视的影响。近年来，研究者从影响靶向精确性的各方面入手对CRISPR/Cas9系统进行了改进，以期尽可能降低脱靶率。

2.1.1 改变gRNA或PAM序列的长度：Cas9剪切的特异性受gRNA和PAM的影响。适当缩短gRNA中互补区的长度可降低脱靶率[6]。而另一项研究中，利用PAM序列更长的嗜热链球菌Cas9(streptococcusthermophilusCas9, StCas9)对人类PRKDC和CARD11基因位点进行编辑，发现其脱靶率显著低于SpCas9[7]。上述两种策略均能在不影响剪切活性的同时降低脱靶效应，并且不同的PAM序列也扩展了该体系靶标的范围。

2.1.2 改变Cas9蛋白构象：除了PAM序列和sgRNA，Cas9的HNH结构域构象状态也可直接调控剪切活性，从而影响与脱靶位点结合的能力。通过突变SpCas9中带正电的特定氨基酸残基，使其转变为电中性，可削弱其与非目标链的互补作用，从而减少脱靶效应，甚至可以在某些情况下使脱靶率降低至检测不到的水平[8]。此外，将锌指DNA结合结构域融合到CRISPR/Cas9系统可添加额外的校对步骤，也可明显改善靶向精确性[9]。

2.1.3 采用配对切口酶：Cas9切口酶(Cas9 nickase, Cas9n)是Cas9缺失一部分酶切活性的突变体，如RuvC失活的SpCas9 D10A突变体，HNH失活的N863A突变体[10]。单一的Cas9n只能诱导DNA单链缺口，且该缺口在真核细胞中常以高保真的方式修复。因此，只有成对的Cas9n，在两条不同的gRNA引导下才可诱导DSB，双sgRNA的识别使编辑准确性也大大提高。

相似的策略还有由dCas9和FokI核酸酶融合而成的fCas9。在两条gRNA的引导下，成对的FokI结合在DNA上距离较近(约15～25 bp)的位置，形成二聚体并激活其核酸酶活性，从而诱导DSB。研究表明，与野生型Cas9相比，该策略可在提高基因编辑特异性的同时实现与配对切口酶相近的效率[11]。

2.1.4 完善脱靶检测方法：提高特异性的前提是具备准确高效的脱靶位点检测方法。目前检验脱靶位点的策略可分为两大类，一是依赖生物信息学算法预测脱靶位点的有偏方法，二是直接检测全基因组内所有DSB的无偏方法[12]。相比之下，无偏法检测更加全面，而有偏法对于特定脱靶位点的检测更加灵敏，因而将两者结合将有助于优势互补，提升对脱靶位点的检测能力。此外，近年有报道表明，多重酶消化基因组测序工具(multiplex digested genome sequencing, multiplex Digenome-seq)可在体外同时绘制多种CRISPR/Cas9核酸酶的全基因组特异性，发现上百种潜在的突变位点[13]。该法具有高效、简便、经济的特点，为脱靶效应的检测提供了新的思路。

2.2 提高编辑效率

Cas9编辑效率的提高是其发展中的另一重要问题，尤其在体内实验及临床相关应用中，高效的编辑使实验有更高的可能性达到预期效果。改善递送系统及选用合适的编辑策略可使编辑效率提高。

2.2.1 改善递送系统：通过使用合适的载体提升递送效率是提高编辑效率的一种策略。腺病毒因其自身基因组很少整合入宿主基因组，且适用于多种细胞类型，在CRISPR/Cas9的在体递送中有良好的效果。由此改造而来的腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)能够转导分裂及非分裂细胞，具有激活细胞DNA修复通路并促进基因靶向的能力，在编辑效率的提高上也极具潜力[14]。

随着技术的发展，各种非病毒载体也应运而生。有研究表明可降解聚合物微粒在递送CRISPR-Cas9时具有比商业脂质体更高的转染效率[15]。此外，可生物降解的脂样物质在体外和体内均可高效递送Cas9 mRNA[16]。

除了递送的载体，递送系统的构成也十分重要。最初的DNA系统存在整合入宿主基因的风险且效率有限，而Cas9 mRNA的递送技术尚未完全成熟。近年来，越来越多的研究使用Cas9蛋白与gRNA重组构成的核糖核酸蛋白复合体进行体内递送，可在降低脱靶率的同时提高同源重组修复[17]。

2.2.2 改善DSB修复策略：目前大部分研究中采取的是HDR修复DSB的策略进行基因编辑。然而，细胞内尚存与HDR竞争的NHEJ修复途径，且在分裂及非分裂细胞中均存在。基于此原理，若能抑制NHEJ的活性则可相对提高HDR的效率，有望提高基因编辑的效率。有研究证实使用Scr7这种DNA连接酶IV抑制剂抑制NHEJ活性，可有效提升大鼠中基因编辑的效率[18]。

此外，利用NHEJ在多种细胞内高活性的特点，近期有研究通过适当改造基因编辑中的供体质粒，使NHEJ也可在CRISPR/Cas9系统的介导下在人类细胞中实现高效的基因敲入[19]。基于NHEJ，近期有研究设计出非同源依赖的靶向整合(homology-independent targeted integration, HITI)系统实现了高效的基因编辑，并使视网膜退化大鼠恢复了部分视力[20]。由于NHEJ在细胞全周期均处于高活性，因而在分裂和未分裂的细胞，体外和体内均能进行高效的基因编辑。新的策略为编辑效率的提高拓展了可能性，同时也弥补了HDR的局限性，如在不具备分裂能力的神经元及心肌细胞中的应用。

2.3 Cas9活性的时空调控

除了提高Cas9靶向的特异性及效率，实现Cas9活性的时空调控对于其应用的拓展和安全性也十分重要。控制Cas9活性的时长既有助于研究生命特定时间点的关键事件，也利于减少Cas9活性时间过长所造成的脱靶突变及其他损害；而在空间层面的调控则有助于从器官、组织，甚或细胞群的层面开展更深入的研究。有研究表明将Cas9分裂成两个片段，形成split-Cas9，通过雷帕霉素与其二聚化结构域的结合可对其进行化学诱导[21]，从而通过给药控制Cas9活性的时长。基于split-Cas9，衍生出光敏Cas9(photoactivatable Cas9, paCas9)，通过蓝光辐射诱导paCas9二聚化功能域，实现对paCas9活性在时间和空间上的双重调控[22]。

3 总结与展望

CRISPR/Cas9系统正在成为强有力的基因编辑工具。其优势在于快速、高效、适用范围广。将其应用于各类真核系统，将有助于对细胞关键分子机制的理解，构造疾病模型，以及药物研发和基因治疗的发展。

随着相关研究的进展，2类CRISPR-Cas系统及各种亚型的探索已有长足进展。除上述Ⅱ型Cas9系统，近期研究表明利用Cas12(前称Cpf1或C2c1)的Ⅴ型系统及含有Cas13(前称C2c2)的Ⅵ型系统[23]也可进行基因编辑，且在某些情况下具有比Cas9更高的效率[24]。此外，近两年还发展出了基于CRISPR系统的碱基编辑，利用胞嘧啶脱氨酶，通过诱导C->T转变或胞嘧啶的多样性改变实现特定碱基的编辑[25]，进一步扩展了CRISPR的应用前景。

近年来关于靶向特异性与编辑效率的提高已进展颇多，通过氨基酸残基的突变改变Cas9构象，以及利用NHEJ的修复策略进行基因敲入等都为CRISPR/Cas9技术的优化带来了新的思路。但随着该技术未来在临床研究及治疗中的应用，这两大关键问题仍是关系到安全与效果的关键因素，值得引起研究者的注意，并开展更加深入的研究。相信随着CRISPR/Cas9技术的不断革新和优化，它将为功能生物学、生物技术和基因治疗等各领域带来新的契机。

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