长链非编码RNA调控乳腺癌侵袭与转移的研究进展

邹子归，周晋星，马天时，张智弘

(南京医科大学第一附属医院 病理科， 江苏 南京 210029)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，也是女性癌症死亡的主要因素，每年全球有超过100万的女性被诊断患有乳腺癌，其中约有40万人死亡。尽管早期筛查乳腺癌在中国已得到广泛应用，但乳腺癌的发病率和病死率仍呈现上升趋势。微阵列技术和高通量测序等科学技术的发展，丰富了人们对非编码RNAs(non-coding RNAs，ncRNAs)的认识，尤其是对长链非编码RNAs (long non-coding RNAs，lncRNAs)的认识。越来越多的研究显示lncRNAs参与了包括乳腺癌在内的多种恶性肿瘤的生物学进程，尤其是恶性肿瘤的侵袭转移。因此，探索lncRNAs介导的乳腺癌侵袭转移的分子机制，对乳腺癌的诊断、治疗及预后评估都有至关重要的作用。

1 lncRNAs的生物学特征

人类基因组序列中仅有<2%的序列编码蛋白质，其余的超过98%的基因组则被转录成ncRNAs。过去，人们将ncRNAs视为“转录噪音”，然而随着高

通量测序等技术的发展，ncRNAs在细胞及生物增殖分化和代谢等方面所发挥的重要作用越来越为人们所重视。其中，长度超过200 nt的ncRNAs被称为lncRNAs，通常是由RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ， RNA pol Ⅱ)转录生成[1]。lncRNAs参与选择性剪接、蛋白质活性调节和表观遗传控制(DNA甲基化、染色质重塑、组蛋白修饰和基因沉默)等多种生物学进程[2]。lncRNAs可以作为信号分子或microRNAs(miRNAs)靶位点的诱饵发挥作用；能与相应的蛋白绑定，影响其下游序列的反应；可以指导靶基因募集染色质修饰酶或其他蛋白，也可以为蛋白质复合物形成一种特定的结构，使其能够装配两种表面修饰酶，从而发挥其相应作用[1]。

2 与乳腺癌的侵袭转移相关的lncRNAs

LncRNAs不仅参与了人体的生理进程，也参与了肿瘤的发生发展。lncRNAs可以作为癌基因，也可以作为抑癌基因参与肿瘤的进程。此外，某些lncRNAs在原发肿瘤和转移灶中呈现不同的表达形式[1]。至今为止，大量研究显示有许多lncRNAs在乳腺癌中异常表达，例如HOTAIR、MALAT- 1、BCAR4、CCAT2、H19、XIST和BC200等，它们参与乳腺癌细胞的增殖、凋亡，影响肿瘤生长和血管形成，调控乳腺癌的侵袭转移。

2.1 肺腺癌转移相关转录物1(metastasis-associa-ted lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT- 1)高表达可作为潜在的生物标志物

MALAT- 1 又称核富集常染色体转录物2(nuclear-enriched abundant transcript 2，NEAT2)，位于染色体11q13.1，其长度为8 708 bp。MALAT- 1在包括乳腺癌在内的多种类型的肿瘤中表达升高，且与肿瘤的侵袭转移密切相关。MALAT- 1可与RNA结合蛋白HuR结合形成抑制性复合物，这种复合物通过与肿瘤干细胞标志物CD133的启动子结合，对CD133进行负性调控，影响上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)程序的进行，从而影响乳腺癌的侵袭和转移，且CD133在三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)中的表达较雌激素受体(estrogen receptor，ER)阳性的乳腺癌高，因而TNBC中侵袭转移的现象更为多见[3]。MALAT- 1可竞争性结合miRNA- 1，使其表达水平降低，从而提高细胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42，cdc42)的表达水平，进而促进EMT的进程，影响乳腺癌的侵袭转移[4]。此外，MALAT1在多种类型的乳腺癌中高表达，且MALAT- 1的表达与ER及其在乳腺癌中的靶基因相关，并可以作为敏感性的内分泌治疗的潜在生物标志物，具有重要的预后价值[5]。

2.2 BCAR4(breast cancer anti-estrogen resistance 4)与抗雌激素药物的耐药性密切相关

BCAR4位于染色体16p13.13，是在一次寻找乳腺癌内分泌抵抗相关基因的探索中被首次发现的，且BCAR4与抗雌激素药物的耐药性密切相关，并会促进乳腺癌细胞的增殖和转移[6]。细胞外趋化因子CCL21将其信号传递至细胞中，间接募集BCAR4，使其与p300抑制剂Smad核相互作用蛋白1(Smad nuclear-interacting protein 1，SNIP1)结合，BCAR4与SNIP1的结合可使p300的组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase，HAT)活性释放，从而导致组蛋白乙酰化，其中组蛋白H3K18ac的乙酰化使丝氨酸/苏氨酸-蛋白磷酸酶1调节亚基1(serine/threonine-protein phosphatase 1 regulatory subunit 10，PPP1R10/PNUTS)对蛋白磷酸酶1(protein phosphatase 1，PP1)的活性抑制解除，促进RNA聚合酶Ⅱ Ser5(Pol Ⅱ Ser5)去磷酸化，导致胶质瘤相关致癌基因同源物2(glioma-associated oncogene homolog 2,GLI2)靶基因的转录，从而促进乳腺癌的侵袭转移[6]。

2.3 HOX转录反义RNA (HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)对乳腺癌的预后有重要意义

HOTAIR是位于染色体12q13.13上，长度为2 158 nt的lncRNA。HOTAIR是最早被报道的参与肿瘤发生发展的lncRNAs之一，它在多种类型的肿瘤中高表达。体外实验证明HOTAIR可以促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移，并能抑制肿瘤细胞的凋亡。HOTAIR的5′末端与多梳抑制复合物2(polycomb repressive complex2，PRC2)结合，进而影响复合物对组蛋白 H3第27位赖氨酸的三甲基化作用 (histone H3 tri-methylated at lysine 27，H3K27me3)，从而沉默靶基因表达，其3′末端与组蛋白去甲基化酶LSD1/CoREST/REST复合物结合，使组蛋白H3第4位赖氨酸去甲基化从而激活相应基因的表达[7]。HOTAIR通过表观沉默MiR- 568，减弱其对活化T细胞的核因子5(nuclear factor of activated T cells 5，NAFT5)的负调控，上调钙结合蛋白 S100A4、血管内皮细胞生长因子C(vascular endothelial growth factor C,VEGF-C)，促进EMT进程和乳腺癌的侵袭转移[8]。HOTAIR可抑制位于2号染色体上的HOXD基因的转录，被抑制的HOXD与miR- 7启动子结合的能力减弱，miR- 7的表达水平降低，进而使癌基因SETDB1的表达水平升高，STAT3通路激活，从而促进EMT进程和乳腺癌的侵袭转移[9]。此外，HOTAIR与ER阳性的乳腺癌密切相关，可作为ER阳性的乳腺癌的独立预后因素，高表达的HOTAIR也预示乳腺癌细胞增殖和高侵袭转移风险[10]。

2.4 H19通过MiR- 675影响乳腺癌的侵袭转移

H19在70%的乳腺癌中高表达。H19位于染色体11p15.5，仅表现母系印记特征，H19与其等位基因胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2，IGF2)共用增强子，IGF2则表现父系印记特征。过表达H19可使乳腺癌细胞MDA-MB- 231在软琼脂中形成比对照细胞更大更多的集落，注射H19转染的细胞的裸鼠，其肿瘤进展加快[11- 12]，这说明高表达的H19对乳腺癌的发生发展存在一定影响。源自H19的保守性转录物MiR- 675可下调泛素连接酶E3家族成员c-CbI和CbI-b的水平，从而使表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor,EGFR)的表达水平升高，EGFR可通过Akt和Erk信号通路促进乳腺癌细胞的增殖和侵袭转移[13]。H19可以通过MiR- 675促进Slug的表达，从而下调E-钙黏蛋白(E-cadherin)，影响EMT进程，进而影响乳腺癌的侵袭转移[14]。

此外，在H19 /IGF2基因座内，存在另一种lncRNA 91H，其对H19基因是反义的。91H在乳腺癌细胞中高表达，并可以通过表观遗传学修饰上调H19/IGF2的水平从而影响乳腺癌的侵袭转移[15]。

2.5 LincROR(long intergenic non-protein coding RNA，regulator of reprogramming，lincROR)发挥竞争性內源RNA功能影响乳腺癌的进程

LincROR位于染色体18q21.31，长度约2 600 bp，由4个外显子组成。LincROR可以与miRNA核糖核蛋白复合物(microRNA ribonucleoprotein complex,miRNPs)相互作用并作为竞争性內源RNA(compe-ting endogenous RNA，ceRNA)调节miR- 205的活性，抑制其下游靶基因ZEB2的降解，从而促进EMT的进程，促进乳腺癌的侵袭转移[16]。LincROR在TNBC中高表达，且LincROR可发挥ceRNA的功能，沉默miR- 145，使其下游重要的靶基因ADP核糖基化因子6(ADP-ribosylation factor 6，ARF6)水平升高，进而改变E-cadherin的定位及细胞间连接，从而促进乳腺癌的侵袭转移[17]。

2.6 结肠癌相关转录物2(colon cancer associated transcript 2，CCAT2)影响信号通路促进乳腺癌的侵袭转移

CCAT2位于染色体8q24，此区域高度保守。目前，CCAT2已被发现参与多种肿瘤的形成与发展，如胃癌、食管鳞癌和乳腺癌等[18- 19]。CCAT2在乳腺癌中的表达水平显著升高，高表达的CCAT2可促进乳腺癌中TGF-β、Smad2和 α-SMA的蛋白表达量，而TGF-β信号通路对EMT的进程有重要的促进作用，由此促进乳腺癌的侵袭转移[19]。此外，CCAT2可影响Wnt/β-catenin信号通路的转录活性，并影响其下游靶基因CCND1和c-myc的水平，在乳腺癌的发生发展中具有重要作用[18]。

2.7 其他LncRNAs

除了上述lncRNAs之外，人们还发现了许多与乳腺癌的侵袭转移相关的新兴lncRNAs，如MEG3、AK058003、肝细胞肝癌微血管浸润相关长链非编码RNA(LncRNA associated with microvascular invasion in hepatocellular carcinoma，MVIH)、LOC554202、LINC00628和抗分化非编码RNA(anti-differentiation ncRNA，ANCR/DANCR)等。

AK058003在乳腺癌组织中的表达水平显著升高，且AK058003可能通过影响γ突触核蛋白基因(γ-synuclein gene，SNCG)的表达水平，从而促进乳腺癌的增殖和侵袭转移[20]。MVIH最早在肝细胞肝癌中被发现，在乳腺癌组织中高表达，MVIH的表达水平可影响细胞周期及细胞的增殖和凋亡，因此可能和乳腺癌的侵袭转移相关。此外，MVIH与乳腺癌的预后密切相关，可以作为乳腺癌的一种新型生物标志物和潜在治疗靶点[21]。LOC554202在乳腺癌组织中高表达，且与肿瘤大小和临床分期相关，高表达的LOC554202可促进细胞增殖、抑制凋亡，影响细胞周期，并可促进乳腺癌的侵袭转移进程[22]。

MEG3在乳腺癌组织和细胞系中低表达，且低表达的MEG3通过减少MDM2 mRNA的转录，间接引起P53蛋白的累积，累积的P53在没有细胞应激的状态下转录上调P21、Maspin和KAI1，从而抑制乳腺癌的侵袭[23]。LINC00628在乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中低表达，且过表达LINC00628可影响细胞周期，抑制乳腺癌细胞的侵袭转移，并可通过Bcl-2/Bax/caspase-3信号通路促进细胞凋亡[24]。ANCR在乳腺癌和乳腺癌细胞系中低表达，ANCR与EMT的诱导者EZH2结合，促进CDK1与EZH2的相互作用以促进EZH2在Thr-345和Thr- 487的磷酸化，并且最终通过泛素-蛋白酶体途径强化EZH2泛素化降解，从而抑制EMT的进程，抑制乳腺癌细胞的侵袭转移[25]。

3 小结与展望

随着分子生物学技术的不断发展进步，越来越多的与肿瘤相关的lncRNAs被发现。LncRNAs在乳腺癌的侵袭转移过程中同样具有重要地位，现有的研究发现，其介导乳腺癌的侵袭转移涉及EMT、血管形成等多个方面，且部分lncRNAs(如本文提及的MALAT- 1、HOTAIR和MVIH等)已经显示出预测乳腺癌分期、存活率、乳腺癌转移以及作为乳腺癌诊断的生物标志物的潜能，然而理想的生物标志物必须在生物体液(如血浆和尿液)中具有稳定性，但lncRNAs的稳定性在很大程度上是未知的。此外，lncRNAs作为生物标志物仍然需要进一步的分析和临床实践来验证。在治疗方面，RNA治疗乳腺癌仍然存在许多挑战，如最佳的给药剂量方案、给药途径缺乏安全性、特异性和有效的载体等，因此将其应用于临床仍然存在一定的障碍。

然而对于大量的新兴的、具有特征性的lncRNAs功能作用的研究和认识，为乳腺癌的治疗和生物标志物的应用提供了新的思路。除此之外，lncRNAs可与miRNA、mRNA和蛋白等相互作用，影响信号传导通路和自噬的进程，从而影响乳腺癌的侵袭转移，因此，对lncRNAs的研究不应局限于lncRNAs本身，全面系统地研究lncRNAs调控乳腺癌侵袭转移的机制以清晰地反映其在区分乳腺癌组织和正常组织及辨别乳腺癌分期的潜力、寻找具有高度特异性和敏感性的lncRNAs和进一步完善RNA治疗的效果，对乳腺癌的预防、诊断和治疗均具有至关重要的作用，也是未来研究的重要目标。

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