副鸡禽杆菌LAMP检测方法的建立

梅 晨，李淑芳，徐玉智，张培君，龚玉梅，王宏俊

(北京市农林科学院畜牧兽医研究所/畜禽疫病防控技术北京市重点实验室，北京 100097)

副鸡禽杆菌(Avibacteriumparagallinarum,Apg)是鸡传染性鼻炎的致病菌，该菌培养条件较为苛刻，需要在培养基中加入烟碱腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)和血清，培养时需厌氧环境或在体积分数为3%～10%的CO2环境。本病广泛分布于世界各地，潜伏期短，传播迅速，短时间内便可波及全群[1]。目前对该菌鉴定常用的靶基因是16 S rRNA，聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)已成为病原菌检测和鉴定的一种强有力工具。副鸡禽杆菌的生化反应复杂，不同毒力的菌株会有不同的结果；间接血凝试验虽是目前最准确有效的方法，但此方法用时较长；PCR虽然特异性强，但是需要的PCR扩增仪昂贵。2000年Notomi T等[2]发明了环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用链置换型DNA聚合酶，能在等温条件下 (60℃～65℃ )，1 h内特异地扩增出109～1010拷贝靶序列，扩增结果可直接对扩增副产物焦磷酸镁沉淀通过肉眼进行判断或检测其浊度，也可用结合双链的荧光染料优选 SYBR Green Ⅰ染色，即可通过肉眼判定。在保持传统PCR优点的基础上，进一步提高了反应的特异性，同时缩短了检测时间。环介导等温扩增技术在疾病的快速检测方面发展迅速，已广泛用于对细菌、病毒、寄生虫的检测和动物胚胎性别鉴定等领域[3-11]，是很有发展前景的快速诊断方法之一。

本研究针对副鸡禽杆菌保守基因16 S rRNA设计LAMP引物，优化LAMP反应条件，建立了检测副鸡禽杆菌的LAMP，并对该方法的特异性和灵敏度进行分析比较。

1 材料与方法

1.1 材料

副鸡禽杆菌3个血清型的标准株，A型的0083、B型的0222、C型的Modsto以及10株国内分离株，北京市农林科学院畜牧兽医研究所保存，参考天根生物公司基因组DNA提取试剂盒说明书提取该菌基因组用作后续试验的模板；14株非副鸡禽杆菌病原微生物如表1所示。

1.2 方法

1.2.1 引物 根据GenBank数据库副鸡禽杆菌16 S rRNA基因(GenBank：BG577820.1)参考序列，用Clustal W进行多重比对，对保守区域序列进行分析，确保扩增的特异性。用LAMP引物设计软件Primer Explorer V4.0设计特异引物序列，引物由生工生物工程(北京)有限公司合成。设计2组引物，外引物F3：5′-CAAGCGGTGGAGCATGTG-3′，B3：5′-ATCACTGGCAGTCTCCTTTG-3′；内引物FIP：5′-CTAAGCTCCCGAAGGCACTCCGATGCAACGCGAAGAACCT-3′，BIP：5′-TGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAACGAAGTGCTGGCAACAAAG-3′。

表1 菌(毒)株及其编号

1.2.2 LAMP反应体系的建立 不同反应温度的优化，25 μL LAMP反应体系包括：Apg基因组DNA 2 μL～3 μL，20 mmol/L Tris-HCl(pH8.8,25℃)，10 mmol/L KCl，10 mmol/L (NH4)2SO4，1 mL/L的TritonR X-100，0.8 mol/L甜菜碱(betaine)，8 mmol/L MgSO4，1.4 mmol/L dNTPs，8 000 U/mLBstDNA polymerase 1.0 μL，加入的引物量为5 pmol F3和B3，40 pmol FIP和BIP；参照文献资料[12-14],反应条件为分别置于61.0、62.0、63.0、64.0、65.0、 66.0、67.0℃的恒温环境中60 min，并在80℃持续10 min，用20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 LAMP灵敏度的评价 将培养后的细菌提取DNA ( 原始核酸含量为1.7×106pg) 进行10倍梯度稀释，分别进行LAMP和PCR检测，其中PCR引物为LAMP的外引物(F3和B3)。LAMP反应体系为:10×LAMP buffer 2.5 μL，F3(5 pmol/μL)1 μL，B3(5 pmol/μL)1 μL，FIP(40 pmol/μL)1 μL，BIP(40 pmol/μL)1 μL，BstDNA聚合酶1 μL，dNTPs(10 mmol/L)3.5 μL，待检样品DNA 2 μL，无菌去离子水12 μL。上述反应体系配制于PCR管中，同时设置阳性对照和阴性对照；LAMP反应条件：将上述配置完成的含反应体系的PCR管混匀后瞬时离心，置于水浴锅中65℃反应60 min，并在80℃持续10 min，用20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测；PCR反应体系为:2×TaqPCR star Mix(GenStar)12.5 μL，F3(10 mmol/L)1 μL，B3(10 mmol/L)1 μL，待检DNA样品2 μL，无菌去离子水8.5 μL。上述反应体系配制于PCR管中，同时设置阳性对照和阴性对照；PCR反应条件：将上述配置完成的含反应体系的PCR管混匀后离心，PCR检测体系扩增参数具体为：94℃ 5 min;94℃ 20 s，55℃ 15 s，72℃ 15 s,共32个循环；72℃ 10 min，4℃结束反应，用20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 LAMP的特异性 用上述LAMP对14株非副鸡禽杆菌的病原微生物进行特异性评估，将试验菌株复苏培养后提取基因组DNA，按上述LAMP进行检测，65℃反应60 min。

2 结果

2.1 最适反应温度的确定

设置了7个温度梯度，由图1可以看出，阳性都呈现出典型的特异性梯状条带，说明61.0℃～67.0℃温度下都能进行反应，而阴性则无此现象，所以选择65.0℃作为后续试验的反应温度。

M.DNA 标准DL 5 000;1～7.61.0、62.0、63.0、64.0、65.0、66.0、67.0℃;8.阴性对照

M.DNA Marker DL 5 000;1-7.61.0,62.0,63.0,64.0,65.0,66.0,67.0℃;8.Negative control

图1 LAMP最佳温度筛选

Fig.1 The best temperature screening of LAMP reaction system

2.2 灵敏度的评价

设置了不同浓度的DNA梯度，LAMP的电泳检测结果见图2，呈现出典型的特异梯形条带，在第9条泳道可看到较清晰的条带，所对应DNA浓度为0.17 pg/管，而第10条泳道之后完全看不到扩增条带；PCR的电泳检测结果见图3，在第7条泳道可以看到略暗的条带，所对应DNA浓度为56 pg/管，而第8条泳道完全看不到扩增条带。综上结果，本试剂盒的LAMP最低检出限0.17 pg/反应，PCR的最低检出限56 pg/反应，说明本检测方法具有较高的灵敏度和应用价值。

M.DNA 标准DL 5 000;1.阳性对照;2～10.1.7×106、1.7×105、1.7×104、1.7×103、1.7×102、1.7×101、1.7×100、1.7×10-1、1.7×10-2pg/管；11.阴性对照

M.DNA Marker DL 5 000;1.Positive control;2-10.1.7×106,1.7×105,1.7×104,1.7×103,1.7×102,1.7×101,1.7×100,1.7×10-1,1.7×10-2pg/tube；11.Negative control

图2 LAMP内引物灵敏度试验

Fig.2 The sensitivity test of LAMP by using inner primer

M.DNA 标准DL 5 000;1～8.1.7×106、1.7×105、1.7×104、1.7×103、1.7×102、1.7×101、1.7×100pg/管；9.阴性对照

M.DNA Marker DL 5 000;1-8.1.7×106,1.7×105,1.7×104,1.7×103,1.7×102,1.7×101,1.7×100pg/tube；9.Negative control

图3 LAMP外引物灵敏度试验

Fig.3 The sensitivity test of LAMP by using outer primer

2.3 特异性验证

选取了14株非副鸡禽杆菌病原微生物和10株副鸡禽杆菌分离株、3株标准株进行特异性评估试验，结果见图4和图5，只有副鸡禽杆菌显示出特异性扩增，非副鸡禽杆菌无特异性条带。

M.DNA 标准DL 5 000;1～10.分离株；11.阴性对照

M.DNA Marker DL 5 000;1-10.Avibacteriumparagallinarumisolates；11.Negative control

图4不同副鸡禽杆菌分离株LAMP产物电泳结果

Fig.4 Electrophoresis of LAMP products of different strains ofAvibacteriumparagallinarum

3 讨论

LAMP作为一种新型的恒温检测技术，具有灵敏度高、特异性强、检测时间短、操作简便、不需要特殊试剂和仪器设备等优点，所以在临床疾病诊断、微阵列基因芯片的开发及食品卫生质量检验等领域具有广阔的应用前景[13-15]。目前，在LAMP反应不开盖的前提下，其结果判定方式有目视检查浑浊、目视检查染料颜色变化和浊度仪对LAMP反应进行实时监控这3种方法[16]。其中目视检查浑浊法主要依据LAMP反应产生大量的副产物焦磷酸镁白色沉淀而使反应液呈现浑浊，但是当浑浊度较低时，肉眼很难察觉。用实时浊度仪可以更加直观、准确地判定结果，但是需要使用特定的仪器设备。相比较而言，染料比色分析既提高了肉眼的识别率，又可直接用于疫病的现场诊断，是最为简单方便的判定方式。普遍用于LAMP的常用染料主要有SYBR Green Ⅰ、溴化乙锭(EB)、Picogreen、钙黄绿素和HNB等，其中以SYBR Green Ⅰ和HNB的检测灵敏性最高，是钙黄绿素的10倍[16]。

本研究所用的13株副鸡禽杆菌都扩增出LAMP的特异性梯形条带，而非副鸡禽杆菌的14种禽病病原，包括细菌和病毒，都未能扩增出LAMP阳性结果，说明该方法具有很好的特异性；将副鸡禽杆菌的基因组做10倍梯度稀释后用LAMP和PCR进行检测来比较两者敏感性，结果表明，LAMP检出的最低限量是常规PCR的1/300。

M.DNA 标准DL 5 000;1～3.0083、0222、Modesto副鸡禽杆菌标准株；4～17.禽多杀性巴氏杆菌、鸡肠球菌、副溶血性弧菌、单核增生李斯特菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲杆菌、肺炎克雷伯菌、枯草芽胞杆菌、鸡白痢沙门菌、禽流感病毒、鸡毒支原体、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒；18.阴性对照

M.DNA Marker DL 5 000;1-3.0083，0222 and Modesto as three standard strains ofAvibacteriumparagallinarum; 4-17.Pasteurellamultocida,ChickenEnterococcus,Vibrioparahemolyticus,Listeriamonocytogenes,Escherichiacoli,Staphylococcusaureus,Campylobacterjejuni,Klebsiellapneumoniae,Bacillussubtilis,Salmonellapullorum,Avian influenza virus,Mycoplasmagallisepticum,Infectious bronchitis virus,Infectious laryngotracheitis virus;18.Negative control

图5 3株副鸡禽杆菌标准株和14株其他病原标准株的LAMP产物电泳结果

Fig.5 The electrophoretic result of three standard strains of LAMP products ofAvibacteriumparagallinarumand 14 other different pathogen standard strains

本研究建立的LAMP优势在于：高效快捷，可于60 min内完成扩增反应；灵敏度高，DNA样品的检测阈值为0.17 pg；适用范围广，不需要PCR仪等昂贵设备，仅用水浴锅或者保温杯即可实现该检测过程；此方法在显著提高灵敏度的同时大大降低了成本。下一步将把染料比色分析优化到该方法中，以便于肉眼的识别，具有广阔的应用前景。

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