浒苔多糖对鸡免疫增强效果的研究

孙秋艳，沈美艳，朱明恩，李 舫

(山东畜牧兽医职业学院，山东潍坊 261061)

浒苔(Enteromorpha)俗称苔条、海苔，是绿藻石莼科中的水生藻类植物，浒苔多糖(Enteromorphapolysaccharide，EPS)是浒苔的关键活性成分[1]，研究表明，浒苔多糖具有免疫调节的功能[2-4]。然而，EPS对鸡的免疫增强效果鲜有报道。为了探讨EPS对鸡的免疫增强效果，本试验首先给鸡注射不同含量的EPS，然后接种ND La Sota+IB H120二联弱毒疫苗，通过测定抗体滴度、sIgA含量、免疫器官指数、外周血中淋巴细胞比率、血清中IL-2和IFN-γ的含量来评价EPS免疫增强效果，为进一步开发EPS作为新型免疫增强剂应用于畜牧业生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株和疫苗 IBV H120(infectious bronchitis H52)毒株，购自中国科学院微生物研究所。ND La Sota+IB H120二联弱毒疫苗，齐鲁动物保健品有限公司产品(生产批号：150252038)。

1.1.2 主要试剂 鸡新城疫病毒HI试验用抗原、阳性血清与阴性血清，青岛易邦生物工程有限公司产品(生产批号：150138082)；鸡分泌型IgA(sIgA)ELISA试剂盒，上海美旋生物科技公司产品；IL-2 ELISA试剂盒、IFN-γ ELISA试剂盒，美国Sigma公司产品。

1.2 方法

1.2.1 浒苔多糖制备 新鲜浒苔8月份采自青岛海域，按照水煮醇沉法提取，分离纯化后EPS含量为69.2%，置-20℃保存，使用时按试验要求进行稀释。

1.2.2 动物处理 1日龄雄性SPF白羽鸡，购自山东济南SPAFAS鸡场，试验期间所用鸡均在山东畜牧兽医职业学院的SPF动物房严格按照SPF鸡饲养管理要求进行饲养。将192只1日龄SPF鸡随机分成4组，每组48只。Ⅰ～Ⅲ组在2日龄颈部皮下注射浒苔多糖，浒苔多糖含量分别为20、30、40 g/L，Ⅳ组注射生理盐水，剂量均为0.1 mL/只，连续3 d。各组于7、21 d分别点眼滴鼻1头羽份的新城疫-鸡传染性支气管炎(ND La Sota+IB H120株)二联弱毒疫苗。分别于免疫接种后7、14、21、28、35、42、49、56 d从每组随机抽取6只鸡，检测前禁食禁水6 h，进行相关指标检测。

1.2.3 血清中NDV和IBV抗体滴度的测定 无菌采集鸡心脏血2.0 mL注入离心管中，25℃、3 000 r/min离心20 min，取上清，采用中华人民共和国国家标准(GB/T 1655—2008)中的血凝抑制试验(HI)进行NDV抗体滴度的检测。采用中和试验(固定病毒稀释血清方法)进行IBV抗体滴度检测。记录结果均为n lg2。

1.2.4 小肠内sIgA含量的测定 剪取十二指肠至空肠段的鸡小肠10 cm，用无菌生理盐水将内容物冲洗干净，加3 mL含1 g/L牛血清白蛋白和蛋白酶抑制剂的PBS(pH7.2)，室温下孵育5 h后匀浆，3 500 r/min离心10 min，取上清液备用，按照鸡分泌型IgA(sIgA)ELISA试剂盒说明书进行检测。

1.2.5 免疫器官指数的测定 每组鸡称体重，取法氏囊、脾脏和胸腺，用无菌滤纸吸取表面水分后，分别称重，重量与体重之比即为免疫器官指数。

1.2.6 淋巴细胞比率的测定 用EDTA-Na真空无菌采血管采集鸡心脏血1 mL，用全自动血液分析仪测定血液内淋巴细胞比率。

1.2.7 血清中IL-2和IFN-γ含量的测定 无菌采集鸡心脏血2.0 mL注入离心管中，37℃静置1 h，4 000 r/min离心15 min，取上清，置-20℃保存备用，按照IL-2 ELISA试剂盒和IFN-γ ELISA试剂盒操作步骤进行IL-2和IFN-γ含量的测定。

2 结果

2.1 血清中NDV和IBV抗体滴度的变化

各组血清中NDV、IBV抗体滴度变化见表1和表2。结果显示，Ⅰ～Ⅲ组血清中NDV、IBV抗体滴度显著高于Ⅳ组(P<0.05)；Ⅱ组血清中NDV、IBV抗体滴度极显著高于Ⅳ组(P<0.01)，显著高于Ⅰ和Ⅲ组(P<0.05)；Ⅲ组血清中NDV、IBV抗体滴度显著高于Ⅰ组(P<0.05)；各组血清中NDV、IBV抗体滴度均在免疫后21 d达到高峰，28 d略有下降，然后迅速回升，49 d时抗体滴度达到最高水平，56 d开始下降，高水平抗体滴度维持时间较长。

2.2 小肠内sIgA含量的变化

各组小肠内sIgA含量变化结果显示，Ⅰ～Ⅲ组小肠内sIgA含量极显著高于Ⅳ组(P<0.01)；Ⅱ组小肠内sIgA含量显著高于Ⅰ、Ⅲ组(P<0.05)；Ⅲ组小肠内sIgA含量显著高于Ⅰ(P<0.05)；各组小肠内sIgA含量均在免疫后21 d达到高峰，28 d略有下降，然后迅速回升，49 d时达到最高峰，56 d开始下降(图1)。

2.3 免疫器官指数的变化

各组免疫器官指数的变化结果显示，Ⅰ、Ⅲ组的胸腺、法氏囊指数显著高于Ⅳ组(P<0.05)，脾脏指数极显著高于Ⅳ组(P<0.01)；Ⅱ组胸腺、脾脏和法氏囊指数显著高于Ⅰ、Ⅲ组(P<0.05)；Ⅱ组各免疫器官指数均极显著高于Ⅳ组(P<0.01)(图2)。

2.4 淋巴细胞比率的变化

各组外周血淋巴细胞比率的变化结果显示，Ⅰ～Ⅲ组外周血淋巴细胞比率显著高于Ⅳ组(P<0.05)；Ⅰ～Ⅲ组外周血淋巴细胞比率差异不显著(P>0.05)(图3)。

表1 血清中NDV抗体滴度的变化

注：Ⅰ～Ⅲ组为浒苔多糖试验组，浒苔多糖含量分别为20、30、40 g/L，分别用20 EPS、30 EPS、40EPS表示，Ⅳ为生理盐水对照组。同列角标相同字母表示差异不显著(P>0.05)；不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

Note：Ⅰ～Ⅲ groups were EPS groups,the contents of EPS were 20,30,40 g/L respectively,20 EPS，30 EPS，40EPS were Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ groups，Ⅳ was normal saline control.The same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and different small letters mean significant difference(P<0.05),and different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01).

表2 血清中IBV抗体滴度的变化

注：Ⅰ～Ⅲ组为浒苔多糖试验组，浒苔多糖含量分别为20、30、40 g/L，分别用20 EPS、30 EPS、40EPS表示，Ⅳ为生理盐水对照组。同列角标相同字母表示差异不显著(P>0.05)；不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

Note：Ⅰ～Ⅲ groups were EPS groups,the contents of EPS were 20,30,40 g/L respectively,20 EPS，30 EPS，40EPS were Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ groups，Ⅳ was normal saline control.The same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and different small letters mean significant difference(P<0.05),and different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01).

图1 小肠内sIgA含量的变化

2.5 外周血中IL-2含量的变化

各组外周血中IL-2含量的变化结果显示,Ⅰ～Ⅲ组外周血中IL-2含量极显著高于Ⅳ组(P<0.01)；Ⅱ组外周血中IL-2含量显著高于Ⅰ组(P<0.05)；Ⅰ～Ⅲ组外周血中IL-2含量差异不显著(P>0.05)；所有组外周血中IL-2含量均在免疫后21 d达到高峰，28 d略有下降，然后迅速回升，49 d时抗体滴度达到最高水平，56 d开始下降(图4)。

2.6 外周血中IFN-γ含量的变化

各组外周血中IFN-γ含量的变化结果显示,Ⅰ～Ⅲ组外周血中IFN-γ含量极显著高于Ⅳ组(P<0.01)；Ⅱ组外周血中IFN-γ含量显著高于Ⅰ、Ⅲ组(P<0.05)；所有组外周血中IFN-γ含量均在免疫后21 d达到高峰，28 d略有下降，然后迅速回升，49 d时抗体滴度达到最高水平，56 d开始下降(图5)。

3 讨论

机体血清抗体效价的变化能够准确、直观地反映体液免疫的状态[5]，Ⅰ～Ⅲ(20 EPS、30 EPS、40 EPS)组血清中NDV、IBV抗体滴度显著高于Ⅳ(NS)组(P<0.05)；Ⅱ组血清中NDV、IBV抗体滴度极显著高于Ⅳ组(P<0.01)，显著高于Ⅰ和Ⅲ组(P<0.05),表明EPS可以显著提高血清抗体滴度。

法氏囊、胸腺和脾脏是鸡的主要免疫器官，这些免疫器官的发育状况及机能强弱直接决定禽类免疫水平[6]。本试验将鸡的法氏囊、胸腺和脾脏重量与体重之比作为免疫器官指数的指标进行研究，结果发现，Ⅰ～Ⅲ(20 EPS、30 EPS、40 EPS)组的胸腺、法氏囊指数显著高于Ⅳ组(P<0.05)，脾脏指数极显著高于Ⅳ(NS)组(P<0.01)；Ⅱ组胸腺、脾脏和法氏囊指数显著高于Ⅰ、Ⅲ组(P<0.05)，极显著高于Ⅳ(NS)组(P<0.01),表明EPS对提高鸡免疫器官生长有一定程度促进作用。

A.胸腺;B.法氏囊;C.脾脏

A.Thymus;B.Bursa;C.Spleen

图2免疫器官指数的变化

Fig.2 Changes of immune organ indexes

图3 外周血中淋巴细胞比率变化

图4 外周血中IL-2含量的变化

图5 外周血中IFN-γ含量的变化

小肠sIgA 含量能够反映体液免疫的状态，本研究发现，Ⅰ～Ⅲ(20 EPS、30 EPS、40 EPS)组小肠内sIgA含量极显著高于Ⅳ(NS)组(P<0.01)；Ⅱ组小肠内sIgA含量显著高于Ⅰ、Ⅲ组(P<0.05)；Ⅲ组小肠内sIgA含量显著高于Ⅰ(P<0.05),表明EPS可以增强疫苗刺激机体产生sIgA的量。

淋巴细胞在机体的免疫应答中具有举足轻重的作用，是反映细胞免疫的直接指标[7]。本研究发现，Ⅰ～Ⅲ(20 EPS、30 EPS、40 EPS)组外周血淋巴细胞比率显著高于Ⅳ(NS)组(P<0.05)，表明EPS对外周血淋巴细胞比率具有促进作用。

辅助T淋巴细胞(Th)是适应性免疫中非常重要的T淋巴细胞[8]，能够释放促炎细胞因子。识别抗原后，激活的Th细胞根据功能和分泌细胞因子的差异可分为Th1、Th2细胞。Th1细胞能够分泌IL-2和IFN-γ，主要介导细胞免疫反应[9-10]。因此外周血中IL-2和IFN-γ的含量可以间接反映细胞免疫的状态。本研究发现，Ⅰ～Ⅲ(20 EPS、30 EPS、40 EPS)组外周血中IL-2、IFN-γ含量极显著高于Ⅳ(NS)组(P<0.01)，表明EPS可提高外周血中IL-2、IFN-γ的含量。

综上说明，EPS对ND La Sota+IB H120二联弱毒疫苗免疫效果具有明显增强作用，可以增强鸡的免疫力，因此EPS可作为免疫增强剂进行开发。

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