口蹄疫病毒O型OHM/02株全长cDNA感染性克隆的构建

苗书魁，魏玉荣，魏 婕，米晓云，汪 萍，马文戈，王 延，薛 英，易 忠，黄 炯*

(1.新疆畜牧科学院兽医研究所/新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心，新疆乌鲁木齐 830011；2．天康生物股份有限公司，新疆乌鲁木齐 830030)

口蹄疫病毒的基因组为单股正链RNA，其RNA位于衣壳内，约有8 500个核苷酸(nt)。反向遗传(reverse genetics)操作技术可以对RNA病毒进行遗传操作，为RNA病毒的分子生物学研究提供了一种工具，这种技术具有较好的稳定性，已在RNA病毒研究领域中广泛应用，该技术是目前FMDV基因组结构与功能研究的重要手段。据报道[2]，自1990年首次利用反向遗传技术成功拯救O型FMDV至今，O[2]、A[3]、Asia1[4]和SAT2[5]等多个血清型的多株FMDV感染性克隆已被成功构建。

FMDV分为SAT1、SAT2、SAT3、A、Asia1、O和C 7个血清型，型间无交叉保护反应。FMDV O型分布比较广泛，是世界口蹄疫的主要流行亚型。本研究以O型OHM/02株为亲本株，扩增获得全长cDNA，利用EcoRV将全长cDNA重组质粒pPO-1的3′末端线性化，与辅助质粒(含有编码T7 RNA聚合酶的真核表达重组质粒)共转染BHK-21细胞，成功拯救出FMDV重组病毒，该拯救毒与亲本毒感染性相似，为FMDV的深入研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和细胞 OHM/02毒株，新疆畜牧科学院兽医研究所和天康生物股份有限公司共建的传染病研究室保存；病毒培养液为含20 mL/L胎牛血清的DMEM液，当细胞的CPE面积为70%左右时，将病毒于-70 ℃保存；BHK-21细胞由本实验室保存，置37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养。感受态大肠埃希菌DH5α和pUC57载体由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂 各种限制性内切酶和T4 DNA连接酶，Thermo公司产品；Trizol Invitrogen公司产品；反转录试剂Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Cat.Not.04896866001)，Roche公司产品；PrimeSTAR DNA聚合酶、Prime Script○ROne Step RT-PCR Kit Ver.2，TaKaRa公司产品；转染试剂Effectene○RTransfection Reagent，自QIAGEN公司产品；一抗为O型FMDV猪阳性血清，天康生物股份有限公司提供；二抗为FITC标记的兔抗猪IgG，Sigma公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与基因合成 根据已知O型FMDV全基因组序列(GenBank：AJ539138)，采用Oligo 6.0软件，将毒株全基因组分为7个重叠的片段，设计合成7对引物(表1，1-7)，扩增全基因组序列。测序拼接后得到毒株全基因组真实序列，将该真实序列分为5个重叠的片段，相应地设计合成5对引物(表1，A-E)用于全序列扩增，同时设计2对用于引入分子标签的引物(表1，F系列)。全长cDNA3′末端下游引物ER中加入EcoRV酶切位点，用于全基因组cDNA的线性化。

表1 病毒基因组全长cDNA扩增和鉴定引物

合成一段含酶切位点的序列(-SpeⅠ-SphⅠ-T7-XbaⅠ-NotⅠ-SmaⅠ-MluⅠ-EcoRV-SpeⅠ-)：TATACTAGT(SpeⅠ)ATAGCATGC(SphⅠ)TAATACGACTCACTATAGGG(T7)TCTAGA(XbaⅠ)GCAGCGGCCGC(NotⅠ)TAAACCCGGG(SmaⅠ)GGAACGCGT(MluⅠ)ATAGATATC(EcoRV)AATACTAGT(SpeⅠ)ATA，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(表1)。

1.2.2 病毒RNA的提取、反转录 病毒RNA提取采用Trizol试剂，反转录过程按照Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit产品说明书操作。

张同波：从十年九亏的军工企业到现在总产能为800万t的钢铁制品综合加工上市企业，新兴铸管走过了一段艰难的历程。新兴铸管股份有限公司的前身是2672工厂，这是20世纪70年代为了解决铁道兵钢材短缺经中央军委批准兴建的，隶属于铁道兵，铁道兵撤编后划归总后勤部。1996年，随着我国国有企业转制，工厂改制为新兴铸管（集团）有限责任公司，也就是现在新兴际华集团的前身。1997年6月，由集团公司独家发起募集设立新兴铸管股份有限公司，其股票在深交所上市。

1.2.3 全长cDNA的构建 改造载体pUC57,设计一对上、下游分别含SpeⅠ酶切位点的引物，通过PCR缺失多克隆位点，则载体pUC57中含有个SpeⅠ酶切位点。

对覆盖全基因组的7个重叠片段扩增及测序，得到OHM/02毒株全基因组真实序列。对真实序列进行分析，设计拼接策略。将先合成的含酶切位点的序列(-SpeⅠ-SphⅠ-T7-XbaⅠ-NotⅠ-SmaⅠ-MluⅠ-EcoRV-SpeⅠ-)与改造的载体pUC57分别用SpeⅠ酶切，然后将该序列克隆至改造的载体pUC57中，构建试验所需的载体pUC57-SpeⅠ-SpeⅠ。

PCR扩增5个相互重叠片段(A、B、C、D和E)，测序鉴定正确后，按照A、D、E、B、C的顺序，分别双酶切后依次克隆至载体pUC57-SpeⅠ-SpeⅠ中，转化感受态细胞DH5α，提取质粒，酶切及测序鉴定得到阳性质粒(图1)。将构建的全长cDNA克隆命名为pPO-1。用EcoRV将其酶切线性化，纯化后置-20℃保存。

图1 FMDV基因组拼接策略示意图

1.2.4 T7 RNA聚合酶的真核质粒pT7RNAP的构建 以BL21(DE3)细菌为模板，上游引物T7RNAP-F：5′-CTGGGATCCACCATGAACACGATTAACATCGC-3′；下游引物T7RNAP-R：5′-CTGGAATTCTTACGCGAACGCGAAGTCCGACTC-3′，PCR扩增T7 RNA聚合酶基因，克隆至表达载体pcDNA3.1中，构建重组质粒pT7RNAP。

1.2.5 转染 待单层BHK-21细胞面积约75%时，取线性化的pPO-1和pT7RNAP质粒各2 μg，参照Effectene○RTransfection Reagent转染。同时设正常细胞对照。转染后培养6 h，加入含80 mL/L胎牛血清的DMEM液继续培养72 h后，将病毒液反复冻融3次，在BHK-21细胞上连续传代，当出现典型的CPE时，病毒液置-70℃保存。

1.2.6 间接免疫荧光试验(IFA) 拯救病毒和亲本病毒分别接种于96孔板中的BHK-21细胞，设正常细胞作为阴性对照，培养12 h，用预冷的无水乙醇固定，漂洗并吸尽残液，加入FMDV猪阳性血清(1∶20)，置湿盒中1 h，用PBS洗涤，加FITC标记的兔抗猪IgG (1∶200)，置湿盒孵育50 min，再用PBS洗涤后于倒置荧光显微镜下观察，Nikon成像系统拍照。

1.2.7 病毒粒子的电镜观察 取拯救病毒感染的BHK-21细胞培养物1 mL，加入FMDV猪阳性血清，37℃温育2 h，置4℃过夜，12 000 r/min离心30 min，弃上清，沉淀用100 μL PBS溶解后负染色，电镜观察病毒粒子形态。

1.2.8 拯救病毒的生长曲线 待BHK-21细胞长满单层时，分别将拯救病毒和亲本病毒按105TCID50进行接种，置37℃吸附1 h，用PBS洗涤细胞，吸尽残液，加入培养液继续培养。在接种后第2、4、6、8、10、12、14 h分别收获病毒。用Reed-Muench计算病毒TCID50，绘制病毒生长曲线，比较两种病毒的增殖特性。

2 结果

2.1 FMDV全长cDNA的构建

RT-PCR扩增获得5个相互重叠的片段(A、B、C、D和E)，按照A、D、E、B、C的顺序，分别双酶切并依次连接入载体pUC57-SpeⅠ-SpeⅠ。经序列测定验证所构建的全长cDNA序列完全符合预期设计。并且构建的感染性克隆中7 501 bp处限制性酶切位点BamHⅠ的碱基C被替换为T，可作为区分拯救病毒和亲本病毒的分子标记。

2.2 FMDV的拯救

转染64 h后可见CPE，细胞收缩变圆、脱落、逐渐崩解、形成碎片(图2A)。收获病毒并继续传代，则出现CPE的时间逐代变短，病变愈加明显。当传至第5代时，12 h即可出现明显CPE，70%细胞变圆、脱落；而对照细胞形态正常，未见收缩变圆等特点(图2B)。

2.3 分子标记的验证

序列测定表明，该病毒基因组在7 501 bp处具有酶切位点BamHⅠ，为了区别亲本毒株，在构建全长cDNA克隆时已将7 501位BamHⅠ敲除。选用鉴定拯救病毒分子标签的引物DF和ER，对拯救病毒和亲本毒株进行PCR扩增，将PCR产物胶回收后用BamHⅠ酶切，12 g/L琼脂糖凝胶电泳分析，结果表明，拯救病毒的PCR产物不能被切开，大小约1 000 bp的1个条带，而亲本毒株的PCR产物被切成预期大小为241 bp和760 bp的2个条带，这符合预期结果(图3A)。同时，将PCR产物经琼脂糖凝胶回收后测序，结果证明，亲本毒株的BamHⅠ酶切位点存在(图3B)，而拯救病毒基因中该位点消失(图3C)。所以，排除了拯救病毒过程中亲本毒株污染的可能性。

图2 拯救病毒感染的BHK-21细胞(A)和正常BHK-21细胞(B)(200×)

2.4 间接免疫荧光检测

通过间接免疫荧光检测发现，在拯救病毒(图4A)和亲本病毒(图4B)感染的BHK-21细胞中均观察到特异性免疫荧光，而正常BHK-21 (图4C)细胞无特异性荧光。

2.5 病毒粒子的电镜观察

拯救的FMDV负染后，在电镜下可观察到病毒粒子，为球形，散在分布，直径约25 nm～30 nm(图5)。

2.6 病毒生长曲线

为了比较拯救病毒和亲本病毒的复制能力和增殖特性，制作病毒生长曲线。由图6可知，2种病毒的复制能力和增殖特性相似。

2.7 感染性克隆的稳定性

将感染性克隆pPO-1在DH5α中连续传10次后，对其全基因组测序。结果发现，没有任何碱基的缺失或突变，说明该重组质粒在DH5α中高度稳定；此外，将拯救病毒在BHK-21细胞中连续接种传代，在第5代后，病变时间趋于稳定，与亲本病毒出现CPE的时间接近。因此，该反向遗传系统是稳定的。

A.RT-PCR产物BamHⅠ酶切鉴定;B.有BamHⅠ酶切位点;C.BamHⅠ酶切位点消失;1.DNA标准DL 20 000;2.拯救病毒;3.亲本病毒

A.RT-PCR fragment digested withBamHⅠ;B.BamHⅠ site;C.DeletedBamHⅠ site;1.DNA Marker DL 20 000;2.Rescued virus;3.Parental virus

图3拯救病毒分子标签的鉴定

Fig.3 Identification of the rescued virus byBamHⅠ digestion

A.拯救病毒感染的BHK-21细胞；B.亲本病毒感染的BHK-21细胞；C.正常BHK-21细胞(100×)

A.BHK-21 cells infected with the rescued virus(200×)；B.BHK-21 cells infected with the parental virus(100×)；C.Normal BHK-21 cells(100×)

图4拯救病毒感染BHK-21细胞的免疫荧光检测(100×)

Fig.4 Identification of rescued FMDV in BHK-21 cells by IF assay(100×)

图5 口蹄疫病毒粒子的免疫电镜观察(80 000×)

图6 拯救病毒和亲本病毒的生长曲线

3 讨论

反向遗传操作是从克隆的cDNA产生感染性RNA病毒的过程，实现在cDNA水平上对RNA病毒的人工操作，为RNA病毒研究提供了重要的手段，从而达到研究病毒结构与功能的目的。FMDV是单股正链的RNA病毒，利用反向遗传操作技术能够在DNA水平上对病毒基因组进行人工操作[6]。目前对Asia1型[4，7-9]、A型[10-11]和O型[12-15]口蹄疫病毒的拯救均有报道，但对O型OHM/02毒株建立感染性克隆的研究尚未见报道。

本研究采用OHM/02毒株，通过基因组全序列分段扩增和拼接，与含有编码T7RNA聚合酶的真核表达重组质粒共转染BHK-21细胞，成功构建了O型口蹄疫病毒cDNA感染性克隆，为更加深入地探索FMDV的基因功能、致病机理、毒力变异机制等搭建了技术平台。

病毒感染性克隆的构建一定要获得高质量的病毒RNA，才能准确扩增病毒全长cDNA。FMDV为RNA病毒，由于RNA病毒种的特性，导致难于获得其真实序列。病毒基因组的真实序列对感染性克隆的构建至关重要，为了得到基因组的真实序列，在试验中选择了保真性高的反转录酶和DNA聚合酶，PCR时将扩增循环数设为25个，以此尽量减少碱基的错配率；测序时每个片段的阳性克隆均选7个质粒。

poly(C)长度对FMDV复制能力具有很大的影响，在不同的病毒拯救试验中，其影响各不相同。据Zibert A等[2]报道，poly(C)的长度至少在35个碱基以上，构建的FMDV cDNA才具有感染性；而Rieder E等[15]认为，poly(C)的长度为2时FMDV的感染性同样存在，poly(C)的长度大于6时，A型FMDV的滴度可达到自然毒水平。另有人提出，O型FMDV poly(C) 的核苷酸长度为15、17、29个时，均能构建感染性cDNA[16]。本研究中构建的O型FMDV感染性cDNA含18个C，也具有感染性。

poly(A)尾不但具有稳定病毒基因组结构的功能，而且对维持其感染性也有一定的作用[17]。poly(A)尾的长度与感染性的关系一直存在争议。有人认为poly(A)的长度越长越好，也有人认为长或短在感染性上没有区别[7]。本试验中在毒株3′ 端扩增出22个A，成功地构建了感染性cDNA，可见poly(A)长度与感染性的关系不是确定的，不是越长越好，或越短越好，而是依毒株而定。同时，在T7启动子的核心序列与基因组之间添加了2个G，以期提高体内转录效率。

在病毒拯救中，体外转录系统存在许多缺陷(如操作繁琐、拯救效率低和RNA容易降解等)而导致病毒拯救效率低。但体内转录却具有操作简单、可获得稳定的RNA、试剂价格相对便宜、病毒基因在表达时不需依靠病毒的复制过程等优点而被广泛采用。本研究将线性化的全长cDNA重组质粒pPO-1与表达T7 RNA聚合酶真核质粒共转染BHK-21细胞，获得了拯救的病毒。也有人利用此方法成功地构建了感染性克隆[8,12,18]，说明该方法行之有效，在病毒拯救中可供选用。

[1] Strohmaier K,Franze R,Adman K,et al.Location and characterization of the antigenic portion of the FMDV immunization protein[J].J Gen Virol,1982，59(2):295-306.

[2] Zibert A,Maass G,Strebel K,et al.Infectious foot-and-mouth disease virus derived from a cloned full-length cDNA[J].J Virol,1990,64:2467-2473.

[3] Rieder E,Henry T,Duque H,et al.Analysis of a foot-and-mouth disease virus type A24 isolate containing an SGD receptor recognition siteinvitroand its pathogenesis in cattle[J].J Virol,2005,79:12989-12998．

[4] 王海伟，涂亚斌，周国辉，等.Asia1型口蹄疫病毒感染性克隆的建立[J].中国预防兽医学报，2008，30(12)：915-919．

[5] Van Rensburg H G,Henry T M,Mason P W.Studies of genetically defined chimeras of a European type A virus and a South African Territories type 2 virus reveal growth determinants for foot-and-mouth disease virus[J].J Gen Virol,2004,85:61-68．

[6] Boyer J C,Haenni A L.Infectious transcripts and cDNA clone of RNA virus[J].Virology,1994,198:415-426.

[7] 李 爽，张润祥 ，宋 鸽，等．牛Asia1 型口蹄疫病毒感染性克隆的构建[J].生物工程学报，2009，25(11)：1621-1626．

[8] 李平花，白兴文，卢曾军，等．细胞内转录拯救Asia1型口蹄疫病毒[J].中国农业科学，2009，42(2)：688-693．

[9] 李平花，白兴文，孙 普，等．Asial型口蹄疫病毒含RSD受体识别位点感染性克隆的构建与病毒拯救[J].畜牧兽医学报，2011，42(2)：210-216．

[10] 袁子文，李平花，孙 普，等．一株A型口蹄疫流行毒株全序列的测定及其全长感染性克隆的构建[J].微生物学通报，2016，43(9)：2019-2027．

[11] Bai X W,Li P H,Cao Y M,et al,Engineering infectious foot-and-mouth disease virus in vivo from a full-length genomic cDNA clone of the A/AKT/58 strain[J].Sci China Series C:Life Sci,2009,52(2):155-162.

[12] 杨德成，涂亚斌，王海伟，等．O型泛亚谱系口蹄疫病毒cDNA感染性克隆的建立[J].中国预防兽医学报，2009，31(1)：1-5，15．

[13] 曹伟军，李平花，白兴文，等．口蹄疫病毒O/HN/93疫苗株的拯救及病毒活性鉴定[J].华北农学报，2010，25(3)：32-37．

[14] 卢受昇，赵启祖，刘湘涛，等．口蹄疫病毒O/QYYS/s/06株感染性克隆的构建[J].生物工程学报，2009，25(7)：982-986．

[15] Hema M,Chandran D,Nagendrakumar S B,et al.Construction of an infectious cDNA clone of foot-and-mouth disease virus type O1BFS 1860 and its use in the preparation of candidate vaccine[J].J Biosci,2009,34(1):45-58.

[16] Rieder E,Bunch T,Brown F,et al.Genetically engineered foot-and-mouth disease viruses with poly(c) tracts of two nucleotide are virulent in mice[J].J Virol,1993,67(9):5139-5145.

[17] Barry B,Marvin J G,Howard L B.The relation of poly(a) length to specific of viral RNA:A comparison of different types of foot and mouth disease virus[J]. Virology,1979,98(2):480-483.

[18] Witko S E,Kotash C S,Nowak R M,et al.An efficient helper-virus-free method for rescue of recombinant paramyxoviruses and rhadoviruses from a cell line suitable for vaccine development[J].J Virol Meth,2006,135:91-101.