高职院校鸡新城疫抗体水平检测技能探索与实践

吴 双，王 涛，徐婷婷，王海燕，贺生中，黄银云，陈长春，蔡丙严，谢 静

(江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300)

0 引言

我国高职院校最根本的职能是培养具有实践技能的高素质人才，而职业技能大赛作为检验教育教学质量和人才培养水平的重要方式，目前已经成为展示学生创新能力和素质技能的重要舞台。举办全国高职院校职业技能大赛更具有重大意义，一方面通过大赛展现学生的技能和实践动手能力，另一方面深化教育教学改革、推进校企合作、促进产教高度融合，最重要的是提高了学生专业素质和综合素质的能力，从而促进学生的就业竞争力和就业质量。全国职业院校技能大赛高职组“鸡新城疫抗体水平测定”赛项，是面向在校高职学生开展的全国规格最高、水平最高、参与范围最广的技能比赛之一。2018年全国职业院校技能大赛高职组“鸡新城疫抗体水平测定”赛项考核内容包括试验器材准备(占总成绩的8%)、配制1%鸡红细胞悬液(占总成绩的18%)、血凝试验(占总成绩的20%)、配制四单位病毒(占总成绩的10%)、血凝抑制试验(占总成绩的20%)和抗体滴度报告(占总成绩的24%)六大部分，共涉及59个评分要点，每一步骤的操作稍有不慎均对测定结果影响很大，操作细节决定竞赛的优劣。

对于此次大赛，学院领导高度重视，邀请了各级行业领导、专业相关指导教师、心理咨询教师全方位指导学生备战。经过激烈角逐，我院两名同学在比赛现场沉着自信，发挥出色，取得优异成绩。笔者作为该项目的指导教师之一，回顾比赛，总结经验，期望在今后比赛中取得更好的成绩，同时希望为今后参赛的选手和指导教师提供参考；更期待针对参赛选手的“精英教育”能更好地转向全体专业学生的“课堂教育”。

1 理论知识是源泉

本赛项以国家职业标准《动物疫病防治员》(三级)规定的知识和技能要求为基础，测定方法按照《新城疫诊断技术》(GB/T16550-2008)标准进行[1]，因此要求学生侧重学习国家标准(GB/T 16550-2008)的第5(血凝试验)和第6(血凝抑制试验)两个部分的专业理论知识，学生只有具备扎实的理论知识基础，操作时才能有的放矢，赛场上才能够随机应变，将来工作上才能更好地解决实际问题。学生无须死记硬背操作步骤，只要通过理解每一步操作的目的，多次重复操作自然就牢记鸡新城疫抗体水平的操作流程。

2 器材使用是基石

该比赛中用到的仪器主要有不同规格微量移液器(精准)[2]、离心机(等量对称放置)[3]、托盘天平(平)[4]、微型振荡器(振幅时间宜)等，用到的其他材料主要有96孔V型血凝反应板(干净无划痕水渍)、禽用采血器(密封性良好)、科邦灭菌橡胶外科手套(气密性良好)、烧杯(干净无水渍)、医用防护口罩(遮口鼻)等，需掌握每一种器材的使用原理、操作规范及注意事项等。此外，提供的34项器材并不是全部选用，使用的原则是“够用”，材料的所有标识必须清晰、准确无误。

3 心理素质是变数

参加全国职业院校技能竞赛的每一位参赛选手都承受着一定的压力，而心理因素在比赛中发挥着不可估量的作用。因此，赛前的心理训练重要性是不言而喻且必不可少。首先在全学院范围内进行鸡新城疫抗体水平检测竞赛(包括理论知识考试和实践操作考核两个部分)中选出10-20名初赛选手；紧接进行层层选拔，一方面多次邀请院领导和相关专业教师观摩点评、让参赛选手给其他班级上相关实验课、操作全程录像并回放查找不足之处、突换器材的摆放位置以锻炼选手的协作能力、变换器材以及鸡笼等，尽可能模拟比赛现场的紧张气氛，锻炼参赛选手的心理素质；，之后经过层层筛选，最终选出认真、负责任、有担当、心理素质过硬的2位种子选手参加团体赛。与此同时，邀请专业心理咨询教师不定时谈心以释压；此外，指导教师和选手之间、两位选手之间的关系要非常融洽，大家要做到知无不言言无不尽，指导教师要做到学生的亦师亦友。最后一个重要环节是竞赛前一定要按着主办方指定的时间去熟悉考场，认真观察器材和操作台的方位，研究所用器材的定位；同时清楚赛场内的卫生间方位。

4 移液精准是核心

移液精准首先要确保移液器量程要精准，需要校准移液器再移液。其次是移液要精准，一要调准量程，同时也要注意操作中量程是否移位；二要正确装配吸头(将移液器垂直对准吸头，稍用力下压并向左向右转动即可上紧)并校验吸头是否装紧，吸嘴是否有歪斜或堵塞；三要正确移液，其中0.9%生理盐水、鸡新城疫标准抗原、被检血清样本、鸡新城疫标准阳性血清、鸡新城疫标准阴性血清、1%鸡红细胞悬液和四单位病毒均采用正向移液法(正向移液前均润洗3次以使吸头内表面达到饱和)[5, 6]，用大拇指按到第一档并将吸头尖端垂直浸入液面3mm左右、释放按钮吸入液体，放液时快速按到二挡；红细胞泥用反向移液法[7]；

5 溶液配置是前提

5.1 1%的鸡红细胞悬液的配置

是否“一针见血而不瘀血”将严重影响选手的心理，规范采血前的准备工作(75%酒精棉球、干棉球、抽取适量抗凝剂的采血器)、鸡的保定方法(侧卧)、采血手法(自成一套)、采血后需立即上下轻柔混匀后置于试管架上，之后更换乳胶手套。离心操作要细心，离心管连同离心管套一起置于事先配平好的50mL小烧杯中进行配平，离心转速为2 000r/min，三次离心时间依次为5min、5min和8min，第一次离心后弃净白细胞和血小板程度将严重影响后续操作。利用反向吸液法吸取红细胞泥配成体积分数为1%的红细胞悬液，1%鸡红细胞悬液制备的优劣将直接决定了试验的进度和结果。

5.2 4单位病毒的配置

配制4单位病毒(4HAU)时，首先根据血凝(HA)效价和被检测样本数量，准确计算出抗原和生理盐水用量；然后用移液器精确吸取所需抗原量，吹打到已经加入生理盐水的50mL小烧杯内并充分混匀。因4HAU浓度直接影响试验结果，在备赛初期要做回归实验以校正4HAU 病毒的配制浓度(前2 孔完全凝集且第2 孔为完全凝集的终点)。此外，4HAU要现配现用，不可长时间置于室温中。

6 均匀性是灵魂

6.1 液体的均匀性

本试验加入的液体除商品化的生理盐水外，1%的鸡红细胞悬液、4单位病毒、被检血清加样前要预先混匀。1%鸡红细胞悬液在配制时需彻底用手摇匀或用移液器吹匀，在加样过程中要每加3～5个样就轻轻摇动几下，尤其要注意在血凝抑制试验时要彻底摇匀或吹匀后才可加样，同一试验不可更换红细胞；通过肉眼观察无法判断4单位病毒是否混匀，所以在配制时一定要彻底用手摇匀，时间不要少于30秒，或通过移液器彻底吹均匀；被检血清彻底融化后用手震摇数次即可。

6.2 取液的均匀性

除红细胞泥以外，取其他液体均需要润洗，微量的取液均要润洗相同的次数；正向取液时，移液器排空液体时均需快速打至第二档；取样和倍比稀释时均避免产生气泡，倍比稀释的次数要相同，倍比稀释后的加样一律从后往前加样。尽量在液面同一高度吸取1%的鸡红细胞悬液和4HAU。

6.3 标准样品的均匀性

鸡新城疫标准抗原、鸡新城疫标准阴性血清和鸡新城疫标准阳性血清均按照每次用量分装至无菌指形管中，用前取出避免反复冻融，室温融化至恢复室温，否则会影响他们的效价。每次取出的抗原均需重新测定血凝价才能进行后续试验。

7 操作过程要缜密

HA试验与血凝抑制(HI)试验是检测OIE一类传染病中新城疫和禽流感的常规方法，该方法操作简便、准确、迅速，是在基层临床中广泛推广的检测检疫手段，试验结果受到操作技术影响非常大，所以整个操作过程必须缜密，才能保证试验结果的精准性。

7.1 血凝试验

首先，在反应板横放(1-12孔与操作台边缘平行)，正面编写HA、1、2和3(依次表示的含义为血凝试验，1、2、3排重复)标识。移液器使用时需保持垂直，遵循“缓吸快打”原则，悬空加样需保持吸头嘴与反应板孔之间的距离。

1-12孔每孔加入25uL生理盐水，其中第12孔再补加25uL生理盐水，共加样三横排；更换吸头，在每排第1孔中加入25uL新城疫标准抗原，每加样一次更换一次吸头；将第1孔液体吹打三次后转移25uL混合液至第2孔(倍比稀释时注意吸头深入液面的高度，避免吸入空气产生气泡)，再次吹打均匀转移25uL混合液至第3孔，按照这样的操作依次倍比稀释至第11孔，弃去25uL混合液；每行倍比稀释均需要更换吸头；从后往前1-12孔每孔加入25uL生理盐水；从后往前1-12孔每孔加入25uL 1%鸡红细胞悬液；微量振荡器适度震荡后，静置感作，在静置反应25min后每隔几分钟进行观察一次，待对照孔出现正确的结果后方可读数。此感作期间，需在A4纸上记录操作的关键时间点；将结果记录到实验报告单后再举手示意，静待裁判评判。

7.2 血凝抑制试验

首先，在反应板横放，在第一块反应板正面写上HI①、1-8(依次表示的意思为血凝抑制试验，第1至第8份被检血清)标识，在第二块反应板上标识HI②、8-16(依次表示的意思为血凝抑制试验，第9至第16份被检血清)；在第三块反应板上标识HI③、17-20、+、-(依次表示的意思为血凝抑制试验，第17至第20份被检血清、鸡新城疫标准阳性血清和鸡新城疫标准阴性血清)。后续试验以“板”为单位进行操作。

在等待HA结果期间，HI① 反应板每孔加入25uL生理盐水，第12竖排中的每孔补加25uL生理盐水；更换吸头，在每竖排第1孔依次加入25uL 1-8份待检血清，每加样一次更换一次吸头；倍比稀释至第10孔、弃去25uL混合液(血清易产生气泡且气泡不易破灭，倍比稀释时应特别避免吸入空气而产生气泡)，每行倍比稀释均需要更换吸头；HI② 和HI③ 反应板操作方法同HI① 反应板。在读取HA结果前完成3块反应板的血清倍比稀释工作。

根据HA效价配置适量的4HAU，HI① 反应板1-11孔从后往前加入25uL 摇匀的4HAU，混匀后静置感作；HI② 和HI③ 反应板操作方法同HI① 反应板；在此感作期间记录操作的关键时间点。

以“板”为单位，HI① 反应板从后往前1-12孔每孔加入25uL 1%鸡红细胞悬液，混匀后静置；HI② 和HI③ 反应板操作方法同HI① 反应板；在静置感作25min后隔几分钟进行观察一次，待对照孔出现正确的结果后方可读数；感作期间在A4纸上记录操作的关键时间点；同样将结果记录到实验报告单后再举手示意，静待裁判评判。

8 适宜感作是重点

加完4HAU震荡后的感作时间宜为30min，血凝试验和血凝抑制试验加完1%红细胞悬液震荡的感作时间不能严格按照否达到40min 来判定，需要结合阴性和阳性对照组出现的结果来判定。因为反应时间与加入检测样本的准确性、震荡的强度、震荡的时间和环境的温湿度均有很大关系。本实验需在20℃～25℃室温进行反应，温度过低会导致红细胞沉淀的时间延长、HI试验滴度与标准滴度相差1～2个log2；温度过高会导致试验结果出现快、但会加速新城疫病毒的解离、甚至红细胞的自溶。此外，应避免将反应板置于空调出风口下进行操作和反应，否则会造成液体挥发较快，造成试验结果有偏差。

9 结果判定是关键

结果判定的总分值为34分，包括血凝试验结果判定(10分)和抗体滴度报告(24分)两个部分，在整个竞赛中占比最重(34/100)。结果判定遵循“完全”原则，一是血凝试验结果的判定，在阴性对照成立的前提下，以完全凝集1%鸡红细胞悬液的抗原的最大稀释度，作为该抗原的血凝价；二是抗体滴度的判读，在标准阳性血清和标准阴性血清对照成立的前提下，在对照孔红细胞呈明显钮扣状沉淀到孔底时判定结果，以能完全抑制红细胞凝集(倾斜观察时，红细胞完全流下)的血清的最大稀释度作为该血清的血凝抑制价。其中抗体滴度结果在误差±1范围内均可得全分，这就需要依据上述判断原则对“过渡孔”进行合理的判读。

10 结语

新城疫抗体水平检测赛项是由来自行业一线人员和具有丰富实践经验的专家精心设计的，该赛项不仅拓宽了专业教师和学生的视野，改变了教师的教学观念和学生的学习态度，还提高了师生的学习效率及心理调节能力等。我校在备赛期间，与三所高职院校师生采用“实战”方式进行相互学习和交流，这在一定程度上促进了畜牧兽医类专业之间的交流，为专业建设与课程改革带来新的视角；邀请了行业、企业专家现场指导，同时通过检测临床样品提高学生处理实际生产问题的能力；我校选拔该项竞赛的种子选手来源于动物医学院举行全院范围的初赛，通过该技能竞赛加强了核心技能训练，有效促进了学校建设并完善了实验、实训平台，更好地达到教学目的。为了更好地参与到以后的技能竞赛，在比赛期间，指导教师认真观摩赛场实况转播，不仅要总结自己存在的问题与不足，还要挖掘出他队的出彩之处；赛后的点评环节需认真记录、消化以供学习借鉴。