克柔念珠菌的耐药机制及抗真菌对策研究进展

刘然

（首都医科大学附属北京妇产医院检验科，北京 100026）

0 引言

在临床实践过程中，常出现的会引发感染的念珠菌种类达17种之多，白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌以及近平滑念珠菌就是最为常见的几类致病菌，超过90%的感染由这几类念珠菌导致。抗真菌药物的使用是临床常见的治疗方式，但此类药物的长期大量应用会引发念珠菌耐药性的产生。其中对氟康唑天然耐药的克柔念珠菌对抗真菌药物的耐药率最高，已经成为临床上最为难治的念珠菌，对患者生命构成严重的威胁。对克柔念珠菌的耐药性的产生机制以及相应治疗药物的进一步研究已成为医学界各方关注的重点。针对此，从克柔念珠菌的感染和耐药现状、耐药性产生机理和相关临床诊治策略等不同方面进行了详尽阐述。

1 克柔念珠菌的感染及耐药现状

在国内，因标本来源、时间、地区及气候的不同，各个医院的克柔念珠菌的分离率从1.4%-8.86%不等[1-9]，对氟康唑、伊曲康唑的耐药率从27.78%-100%不等[1-9]，对唑类药物耐药现象严重。台湾地区克柔念珠菌对氟康唑的耐药率相比较2010年从2.2%上升到2.8%，对伏立康唑的耐药率从0.3%上升至0.5%[10]，在另一项美国研究显示，克柔念珠菌对棘白菌素类药物耐药率在2008年仅为4.2%，至2014年，其耐药率已升为7.8%[11]。

2 克柔念珠菌的耐药机制

2.1 对唑类药物的耐药机制

羊毛甾醇14α-去甲基化酶（14α-demythylase，14-DM）是唑类药物耐药机制中的作用靶酶，该酶是由ERG11基因编码产生的，编码蛋白ERG11p，在麦角甾醇生物的合成过程中处于关键位置，是真菌细胞膜的主要甾醇成分，经由和14-DM结合，唑类药物抑制了其生物活性，导致甾醇中间产物的堆积，阻碍麦角固醇的合成，最终使念珠球菌的胞膜结构及功能发生改变，最终产生抗药性。克柔念珠菌对唑类药物的耐药机制可能由以下几种引起。

2.1.1 药物靶酶ERG11编码基因的突变和过度表达

克柔念珠菌的ERG11基因大小为1587bp，耐药株克柔念珠菌中ERG11的mRNA表达增多，和耐药性呈正相关。ERG11基因的突变可导致酶结构变化，最终造成其功能差异，降低和唑类药物间的亲合力，出现耐药性。相关研究结果提示，ERG11基因上G487T（A114S）和T916C（Y257H）的错义突变和唑类耐药相关[12]。有研究[13]提到，Upc2p在调节麦角固醇的代谢中起到了重要作用，可以对外排泵的基因表达产生影响。Upc2p中G648D和A643T的功能性突变，均可造成某一丙氨酸结构改变，变为苏氨酸，刺激ERG11的过度表达，提高菌株耐药性[14]。在唑类耐药的临床分离株中，已报道ERG11p中至少有60个氨基酸被取代[12]。

2.1.2 靶位拷贝数的增多

有关研究提示，当唑类耐药株中的ERG11基因出现拷贝数增加的情况，就会导致有丝分裂重组、基因突变和等臂染色体形成等情况出现，最终提高对唑类药物耐药性发生的几率[15]。

2.1.3 通过药物外排转运蛋白和减少摄取，而降低细胞内药物浓度

真菌中可导致唑类耐药的外排泵主要包括两类，分别是ATP结合盒（ABC）转运蛋白（如CaCdr1和CaCdr2）和主要协同转运蛋白超家族（MFS）转运蛋白（如CaMdr1），前者转运药物使用的能量来源于ATP的水解，后者利用细胞质膜电化学梯度转运底物。在克柔念珠菌中，菌株应对唑类药物暴露时，ABC1会被强力上调，因此它在天然耐药方面，可能发挥了重要作用[16]。临床上已经从暴露于唑类抗真菌药物患者连续分离的菌株中证实，多因素耐药的逐步发展与药物暴露、CDR和（或）MDR基因表达[17]以及其他机制（如ERG11过表达）有关。

2.1.4 其他的麦角固醇的生物合成途径成分的修饰

ERG3基因编码固醇Δ5,6-去饱和酶，有助于固醇的生物合成。相关研究结果显示[18]，把克柔念珠菌至于内含伊曲康唑的培养基中培养，会出现麦角固醇含量减少，14-甲基3,6-二醇含量增多，细胞生长停滞的情况。而提高培养基中氯康唑浓度，则会发生14-去甲基粪甾醇蓄积的情况，据此，我们推测甾醇ERG3在克柔念珠菌耐氟康唑机制中起到了重要影响。

2.1.5 生物膜和持留细胞

生物膜是微生物自然生长最普遍的形式之一，其特性是抵抗常用抗真菌药物。在生物膜里，药物外排转运蛋白基因CDR和MDR在生物膜形成过程中被上调[19]。持留细胞生长速度不如正常生物被膜细胞，通过“休眠-生长-增殖”应对逆境的胁迫[20]，能够在高浓度抗菌药物下存活并且形成菌落[21]。

2.2 对多烯类药物的耐药机制

2.2.1 细胞壁组分发生变化

以细胞壁与膜作用为基础，两性霉素B对克柔念珠菌的指数生长期进行了抑制，而细胞壁内葡聚糖的水平改变最终导致了耐药性的产生。当真菌细胞壁几丁质含量降低时耐药性产生[22]。

2.2.2 交叉耐药

经由和真菌细胞膜表面的麦角固醇相互结合，多烯类药物让细胞膜表面出现许多微孔，细胞膜完整性受损，膜内重要组成物质外泄，真菌死亡。然而，若真菌抗唑类药物耐药性出现，真菌细胞就会失去合成麦角固醇的能力，最终让两性霉素B的抗菌活性消失。所以唑类药物与多烯类药物间存在交叉耐药[23]。

2.3 对丙烯胺类药物的耐药机制

利用对角鲨烯环氧化酶的抑制作用，丙烯胺类药物扰乱了真菌甾醇的合成进程，造成角鲨烯的细胞内堆积，引起真菌的脂质代谢紊乱，最终起到抗真菌的效果[24]。现阶段见报的与丙烯胺类药物耐药性有关的研究不多,但在临床应用过程中，耐特比萘芬的毛孢子菌属(T richophyton rubrum)已经出现对此类耐药株中所蕴含的角鲨烯环氧化酶进行编码基因的序列解析,研究结果提示所有菌株都含有1个氨基酸突变L 393F。

2.4 对氟胞嘧啶类药物的耐药机制

耐氟胞嘧啶类药物的耐药性产生的机理常是因特定的氨基酸被替换最终造成前体药物的吸收及修饰过程产生变化，最终出现耐药性[25]。还有研究显示，其耐药性可能和胞嘧啶透酶、胞嘧啶脱氨酶缺陷或胸苷酸合酶活性变化有关。

2.5 对棘白菌素类药物的耐药机制

有研究[26]提出棘白菌素的耐药机制一般与以下几类因素有紧密联系：①FKS1基因突变。②细胞膜表明转运蛋白Sbe2P过度表达。③药物过度外排。在这之中，FKS1基因突变的影响已获得了普遍认可。Kahn等[27]的研究结果提示因FKS1中T2080K发生杂合突变，让Phe655→Cys失去了靶酶Fks1p亚单元内的(1，3)β-D葡聚糖合成，最终造成了克柔念珠菌抗棘白菌素的耐药性产生。

3 抗克柔念珠菌对策的研究进展

3.1 建立标准化抗真菌药物敏感实验[28]

近20年来，伴随药敏试验方式的持续完善，抗真菌药物的敏感性结果的真实性更为可信。但也因患者免疫状态的不同，基础疾病的差异，药物间相互影响，抗真菌药物剂量高低区别，疗程长短和血药浓度水平高低的不同，和别种感染因素的影响，如脓肿引流状况，插入导管是否去除等因素造成药敏试验结果与临床治疗情况不符。这就需要我们判断真菌药敏结果要慎重，在将其他会对治疗效果产生不利影响的因素排除后，将最初致感染菌提取出来，同时和治疗失败后分离出的真菌的MIC进行比较，若其MIC显著提升，则显示其耐药性提高。

3.2 新药研发

3.2.1 嗜铬粒蛋白A(CGA)-N46

CGA是分布于内分泌细胞嗜铬颗粒和神经细胞中的一种可溶性蛋白[29]。经过对CGA中不同衍生片段的抗菌活性进行检测，结果提示CGA N端的CGA-46显示出极强的抗真菌活性[30]。CGA-N46能对进行测试的念珠菌属的生长进行抑制，在这之中，克柔念珠菌的敏感性最强。利用暂时对磷脂膜的稳定性进行去除，造成线粒体功能障碍，同时抑制DNA合成，CGA-N46被认为是抗克柔念珠菌感染的最新化合物[31]。

3.2.2 银纳米颗粒（AgNP）

AgNPs指利用环保方式，将半胱氨酸视作还原剂合成产生的。在某些学者的认知中，AgNP可被视为开发新型抗真菌剂的最新化合物，它在成纤维细胞中具有最低的细胞毒性，同时针对具有抗常规真菌化合物抗性的念珠菌属有较强致死性。这就是此类药物的新药研究的潜力体现[32]。

3.2.3 羧甲基壳聚糖（CM-壳聚糖）

Tan[33]等通过深刻研究，显示CM-壳聚糖不论是针对单个和混合物中生物膜的非白色念珠菌，均具有显著抑制作用，常见菌属包括了热带假丝酵母，近平滑假丝酵母，还包括了克柔假丝酵母以及光滑念珠菌。所以CM-壳聚糖不单单可以起到减低念珠菌细胞代谢活性的作用，还可以刺激生物膜的建立和发展，在进行新药物研究中极具价值。

3.2.4 艾沙康唑

艾沙康唑有可预测的和与剂量成正比的药动学，现已完成Ⅲ期临床试验，一般被用来治疗侵袭性念珠菌病、念珠菌血症，还可被用于治疗侵袭性曲霉病和较为少见的曲霉感染[34]。在艾莎康唑的分子结构式中，其侧链具有很高的真菌CYP51蛋白亲和力，造成其抗真菌谱范围更广，甚至将对别种唑类抗真菌药所耐受的真菌也囊括其中[34]。

3.2.5 阿巴康唑

阿巴康唑是一种生物利用度高、抗真菌活性强的口服制剂，针对足廯已完成Ⅰ期试验评价，用于脚趾甲真菌病治疗已完成Ⅱ期临床试验[35]。

3.2.6 福司氟康唑

福司氟康唑是氟康唑的磷酸酯前体药物，是以氟康唑为起始原料通过两部合成。福司氟康唑静脉给药2-3d即可达到有效血药浓度。安全性好，不良反应小[36]。

3.3 联合用药

相关动物结果提示，小檗碱及黄芩素能有效提升唑类药物的抗真菌效应[37]。王维欣等[38]研究表明，没食子酸与氟康唑联用对耐药克柔念珠菌的浮游菌表现出体外协同抗真菌作用。有些研究结果显示[39]，枸橼酸托瑞米芬具有明显提升卡泊芬净及两性霉素B体内外抗生物被膜活性的作用。

3.4 老药新剂型

两性霉素B脂质体是两性霉素B的一种新剂型，发挥其最强杀菌效能的同时降低其毒副作用[26]。20世纪90年代，研发了3种不同的两性霉素B的脂类复合体，分别是两性霉素B脂质体、两性霉素B脂质复合体和两性霉素B胶状分散体。制霉菌素脂质体是游离制霉菌素包裹在多层脂质中，保留其抗菌活性的同时降低其肾毒性。灰黄霉素的卵磷脂脂质体也于20世纪90年代研发，其肝毒性大大低于常规灰黄霉素口服剂。

3.5 抗真菌中草药

中草药因其所具备的来源多、抗菌谱广、毒性小、耐药性产生率低等优势引起了多方关注。有研究提示，大蒜、地锦草、黄芩、鱼腥草等都具备较高的抗真菌性[40]。还有研究对这一轮点进行了进一步肯定[41]，研究显示大蒜素可有效抑制生物膜的黏附和胞外多糖的产生；苦参碱则能够显著阻碍白念珠菌的黏附和菌丝生长；黄芪苷可抑制真菌DNA的合成而达到抗菌作用。

4 小结

克柔念珠菌的耐药现象严重是多种耐药机制共同作用的结果，不同耐药机制的结合也形成了其对氟康唑的天然耐药。在上文中所提及的耐药机制仍待我们的深层次研究，也许会有未发现的耐用机制亟待进一步阐明，从而为研制新的抗真菌药物提供新思路，也可以为临床合理使用抗真菌药物提供理论依据。