黄曲霉菌的分离鉴定及毒性试验

徐洪滨 李四山 张鹏飞

（1.如皋市家畜改良站，江苏如皋市 226500；2.如皋市畜牧兽医站，江苏如皋市 226500；3.四川农业大学 动物医学院，四川成都 611130）

黄曲霉毒素（aflatoxins）是一组化学结构类似的化合物，包括B1，B2，G1，G2，P1，H1，GM，M1，M2，B2a和毒醇。黄霉毒素的基本结构为二呋喃环和香豆素，b1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物。含有一个氧杂萘邻酮（香豆素）双呋喃环和一个双呋喃环。前者为与黄曲霉毒素的致癌性有关，后者是基本的毒性结构。m1可以由黄曲霉毒素b1在体内羟化衍生而成。黄曲霉毒素主要分子型包含b1，b2m1，m2，g1，g2，等。其中黄曲霉毒素m1和m2常在牛奶中被发现，黄曲霉毒素b1的致癌性和毒性是最强的。

黄曲霉毒素g1，g2在紫外线照射下发绿色荧光，而黄曲霉毒素b1，b2则可以发蓝色荧光。黄曲霉毒素的相对分子量为312～346。难溶于水，但较易溶于油，甲醇，丙酮等有机溶剂，但黄曲霉毒素不溶于石油醚，己烷和乙醚中。在中性溶液中，毒素较稳定，在强酸性溶液中，毒素会稍有分解，在ph9-10的强碱溶液中，毒素分解迅速。其纯品结晶后为无色，耐高温，黄曲霉毒素b1的分解温度为268℃。低浓度黄曲霉毒素在紫外线照射下会招到破坏。

土壤，动植物，各种坚果，特别是花生和核桃中可以发现黄曲霉毒素。也被发现存在于玉米，通心粉，牛奶，奶制品，食用油中。食品中黄曲霉毒素在热带和亚热带地区经常被检测出。在我国1980年的记录中，从17个省粮食中共检测出黄曲霉1660株，其中广西地区黄曲霉的检出率为58%，是17个省份中最多的。黄曲霉毒素在我国多分布于华中，华南，华北，并且产毒量也大。而东北，西北地区相对较少。

1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为1类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时，可导致肝癌甚至死亡。

在自然界中寄生曲霉（A 1 parasiticus）和黄曲霉（Aspergili us f lav us）可以产生黄曲霉毒素（Aflatoxin），黄曲霉毒素是它们的次生代谢产物。目前黄曲霉毒素已被发现有17种，其中分布最广泛、含量最高、毒性最强的为黄曲霉毒素B1。通过实验证明，黄霉菌产生的真菌霉素即黄曲霉素，是化学致癌物中，黄曲霉毒素是致癌性最强的物质之一，主要损害肝脏功能并且具有强烈的致癌性、致畸性、致突变性，能引发肝癌、骨癌、肾癌、直肠癌、乳腺癌等。由于黄曲霉素稳定的化学性质，破坏其温度要达到280℃以上。

动物肝脏是黄曲霉毒素主要伤害的器官[14]。研究结果显示，受到黄曲霉毒素伤害的肝脏，功能明显下降，奶牛和家禽感染黄曲霉毒素时，产奶量和产蛋量都会下降，免疫力也会受到影响，病原微生物可以轻易感染机体。黄曲霉毒对幼龄的动物素伤害更大，长期对母畜投喂低浓度黄曲霉毒素的饲料，会导致胚胎内的幼畜死亡。动物的消化系统功能、生育能力都会受到黄曲霉毒素的影响。奶牛的产奶量会因奶牛感染黄曲霉毒素下降，牛奶中还会含有黄曲霉毒素m1和m2[15]，食用会有很大危险。黄曲霉毒素污染饲料，再投喂家畜，使美国畜牧业每年至少因此遭受10%的经济损失。在我国，黄曲霉毒素污染饲料对畜牧业造成的损失更大。

黄曲霉毒素污染的食物被人们食用后，会对人体造成很大的伤害。黄曲霉的污染很难预防，因为真菌在食物中普遍存在。国家卫生部门制定相关的标准，防止被污染的粮食用于食品加工。但如食品中黄曲霉毒素含量低于标准则很难控制。在发展中国家，食用被黄曲霉毒素污染的食品常常导致疾病的发生。研究机构的研究工作表明，肝细胞癌变（liver cell cancer，lcc）多由食用被黄曲霉污染的食品导致，发病率在亚洲和非洲较高。肝癌，胃癌，肠癌等疾病是长时间食用被黄曲霉污染的食品的极端结果。1988年，黄曲霉毒素b1被国际肿瘤研究机构（international agency for research on cancer，iarc）列为可以导致人体癌变的物质。此外，黄曲霉毒素的致癌性可以叠加，其他致癌因素与黄曲霉毒素叠加后致癌性会更强。

黄曲霉毒素主要损害人体的肝脏，病患会有肝炎，肝硬化等症状。临床表现有胃部不适，食欲减退，恶心，呕吐，腹胀及肝区触痛等；严重者出现水肿，昏迷，以至抽搐而死。目前的研究表明黄曲霉毒素是已经发现的最强的致癌物质，其致癌力比二甲基亚硝胺诱发肝癌的能力大75倍，比3，4苯并芘大4000倍。黄曲霉毒素主要诱使动物发生肝癌，胃癌，肾癌，直肠癌等。

本实验从霉变花生上分离下的疑似霉菌菌丝接种于察氏培养基中，通过对菌落颜色、形态的观察和镜检，初步筛选黄曲霉霉菌，然后与黄曲霉菌标准菌株3.4408对照确定为黄曲霉菌。制得含黄曲霉毒素的悬浊液，后进行体外淋巴细胞增殖试验，通过黄曲霉毒素感染淋巴细胞，与增值组、抑制组、实验组对照，最终求得黄曲霉毒素对淋巴细胞的抑制率。证明黄曲霉毒素对细胞具有极大的杀伤力，在生产生活中对黄曲霉菌的污染应该加强控制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

兔

1.2 培养基

察氏培养基（硝酸钠，磷酸氢二钾，硫酸镁，氯化钾，硫酸亚铁，蔗糖）

1.3 材料与药品

花生，肝素，75%酒精，蒸馏水，无菌水，生理盐水。

1.4 仪器与设备

紫外灯，试管，锥形瓶，高压灭菌锅，温箱，接种环，培养皿，移液器，移液管，报纸，玻璃棒，无菌操作台，注射器，针头。

2 实验方案

2.1 黄曲霉菌的培养、分离和鉴定

2.1.1 黄曲霉菌的初培养及初步筛选

将干燥的花生放于阴暗潮湿处，泼上适量水，放置3周，使其霉变。待霉菌长出后观察霉菌孢子和菌丝颜色，挑选少量黄色菌丝镜检，若镜检下，菌丝呈分隔状，分生孢子头呈连珠状，且可见孢子梗上有孢子囊，囊上有分生孢子梗，梗上有分生孢子，整个孢子的形态呈球拍状。则可初步判断为黄曲霉菌。

2.1.2 黄曲霉菌的分离及鉴定

将疑似霉菌接种于察氏培养基，28℃下培养6天，再次使用划线分离法进行菌株的分离，并与黄曲霉菌标准菌株3.4408对照[16]，在荧光显微镜下进行观察，通过观察到的菌株形态来判断疑似菌株是否为黄曲霉菌株。若菌落正面色泽随其生长由白色变为黄色及黄绿色，呈半绒毛状。孢子成熟后颜色变为褐色，孢子表面平坦或有放射状沟纹，观察孢子反面无色或者褐色，在低倍显微镜下观察可见分生孢子头呈疏松放射状，继而为疏松柱状。制片镜检观察，可见分生孢子梗很粗糙。顶囊呈烧瓶形或近球形。分生孢子在小梗上呈链状着生，分生孢子的周围有小突起、球形、粗糙。则可判定其为黄曲霉菌。将已鉴定的培养至第6天的培养基倒置于紫外灯（波长360nm，125w）下观察，菌落周围的培养基中出现特殊的荧光，即为产黄曲霉毒素的阳性菌株。

2.2 黄曲霉的纯化

将黄曲霉菌株接种于察氏培养基上，28℃恒温培养5d。取平板上的单个菌落接种于察氏斜面培养基上，28℃恒温培养5～6d。多次反复接种纯化，然后保存纯种菌株。

2.3 黄曲霉毒素的粗提

在无菌室内操作，在培养的黄曲霉菌培养基中加入10ml无菌生理盐水，制成菌悬液。将菌悬液加入培养瓶中，置于28-30℃恒温培养箱内，相对湿度为85%～94%，培养3d。降温为25℃，培养3d，得含毒培养乳，将以上步骤所得含毒乳用生理盐水稀释，制得含黄曲霉毒素的悬浊液。

2.4 毒性试验

2.4.1 兔外周血淋巴细胞的分离和培养

（1）采血

每次实验均采5ml兔外周血液，添加1ml肝素（5%枸橼酸钠溶液抗凝剂），加入10ml的塑料离心管中。

（2）外周血淋巴细胞的分离和纯化

取5ml肝素抗凝的兔外周血，加入一倍（5ml）的PBS液稀释，轻轻摇匀。将稀释的血液沿管壁加入已盛有5ml淋巴细胞分离液的离心管中，保持界面清晰，2000r/min离心20min。用取样枪伸至单个核细胞层（白色狭带）沿管壁吸出全部单核细胞移入另一离心管中离心，2000r/min离心15min。倒掉上层清液，加入37℃预热的PBS液（约为悬液量的五倍）洗涤2次。第一次2000r/min离心15min；第二次2000r/min离心10min。洗涤后的淋巴细胞团用无菌的 RPMI1640 培养液吹散混匀，于 37℃，5%CO2培养箱中培养。

2.4.2 淋巴细胞的镜检和计数

为了验证淋巴细胞的成活状况，用取样枪吸取分离出来的家兔外周血淋巴细胞100μl，用 PBS 缓冲液 10 倍系列稀释，经吉姆萨染色，在普通显微镜下观察形态，计数每1ml细胞悬液中的淋巴细胞数。同时取 50μl 细胞悬液滴在计数板上，加台盼蓝溶液50μl 充分混匀，3～5min 内在显微镜下观察，计算出活淋巴细胞的百分率。活淋巴细胞百分率=（淋巴细胞总数-死亡淋巴细胞总数）/淋巴细胞总细胞数×100%。

2.4.3 体外淋巴增值细胞试验

在无菌96孔细胞培养板中，设增值组（100μl淋巴细胞液+100μl刀豆+100μl1640培养液）、抑制组（100μl淋巴细胞液+100μl环孢霉素A+100μl1640培养液）、空白组（100μl淋巴细胞液+200μl1640培养液）、实验组（100μl淋巴细胞液+100μl黄曲霉素+100μl1640培养液），所有实验设定三个重复孔。将培养板在37℃，5%CO2的条件下培养箱孵育24h后，每孔加入10μlCCK-8溶液，将培养板再孵育4h，用酶标仪570nm波长测定OD值。计算淋巴细胞抑制率。抑制率=（空白组-实验组）/空白组×100%

3 实验结果

3.1 培养及鉴定

从堆放在阴暗潮湿处的花生、大米和玉米中挑取疑似黄曲霉菌丝接种在察氏培养基，在30℃恒温培养箱培养5d后，可见菌落直径达7cm，菌落颜色为淡黄色，1～2d之后变为黄绿色，两周左右颜色变暗，平坦略有放射状沟纹，反面无色或带褐色。低倍镜下可观察到菌丝分隔现象，孢子头部呈疏松放射状，1～2d后变为疏松柱状，为典型的分生孢子。分生孢子梗多从基质生出，长度一般小于1mm。有些会菌丝产生带褐色的菌核，见图1。

挑选典型的黄曲霉菌菌丝做进一步纯培养，勾取少量菌丝镜检，如图2。可见，菌丝呈分隔状，分生孢子头呈连珠状，且可见孢子梗上有孢子囊，囊上有分生孢子梗，梗上有分生孢子，分生孢子的周围有小突起、球形、粗糙，整个孢子的形态呈球拍状，与黄曲霉菌标准菌株3.4408对照。

图1 黄曲霉菌菌落

图2 黄曲霉菌形态学观察

3.2 兔外周血淋巴细胞的分离

在显微镜下淋巴细胞的形态为小圆核状，细胞核较大，胞质较少，有的相互叠加。经细胞计数板计数，计算得出兔外周血淋巴细胞的细胞数为 2.5×106个/ml，活细胞百分率为 96.8%。

3.3 淋巴细胞OD值

表1 淋巴细胞OD值

实验测得淋巴细胞抑制率为35.3%。

4 讨论

目前的研究发现，黄曲霉毒素至少有20 种左右结构相似的化合物，如黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2及毒醇等，在粮食和食品中黄曲霉毒素主要存在形式为黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1及 M2，在众多的黄曲霉毒素化合物中，黄曲霉毒素 B1的毒性和致癌性是最强。1993 年，世界卫生组织（WHO）癌症研究机构通过研究调查将黄曲霉毒素划定为一类致癌物质，主要伤害的器官是肝脏，引起肝癌以及肝脏的其他病变。黄曲霉菌的适宜生长温度在12℃～42℃，相对湿度在 80%～85%。在环境温度处于24℃～30℃之间时，黄曲霉毒素的产出量最高，并且在之后的两条黄曲霉高速生长并且产毒量不管提升，产生黄曲霉毒素的条件有干燥、低温或黄曲霉与其他霉菌竞争应激情况时。黄曲霉毒素是从作物生长的初期，就会对其造成污染，在农作物收割后粮食的污染通常是由于不良储藏条件（如阴暗）和作物含水量过高所引起，环境温度过高以及环境潮湿会是黄曲霉菌株产生黄曲霉。多数植物能够被黄曲霉毒素污染，如植物性食物，最易受黄曲霉毒素污染的食物有玉米和花生，坚果类食物的果仁也常常受到黄曲霉的污染。

黄曲霉毒素毒性相当于氰化钾的 10 倍，砒霜的 68 倍，毒性非常强危害很大，尤其作用于人和动物的肝脏和肾脏。黄曲霉毒素毒素污染食品被人类食用后，可诱发人体的原发性肝癌、胃癌及肺癌等，从感染黄曲霉毒素到检出癌变最短仅需24周，而且如人体本身携带乙肝病毒，在接触黄曲霉毒素后，患肝癌的概率是常人的 60 倍。农作物生长、收获、加工和储藏的任何环节都可能被黄曲霉毒素污染，如玉米、花生、大豆、大米、食用植物油及饲料等农产品，并且通过人和动物的食用进入食物链，伤害人体以及动物并且污染动物产品如牛奶等。

本实验从发霉花生中提取出黄曲霉，并通过实验室提供适宜条件使黄曲霉菌株产生黄曲霉毒素，最终通过体外淋巴细胞实验得出淋巴细胞抑制率，得到黄曲霉毒素对淋巴细胞有强烈抑制作用的结论。体外淋巴细胞实验的增值组中刀豆素为促细胞有丝分裂素，主要对淋巴细胞有激发作用，抑制组中的环孢霉素主要对淋巴细胞有抑制作用。通过对比抑制组与实验组，可以得出结论黄曲霉毒素可以抑制淋巴细胞的生长，并且通过OD值的计算可以得到淋巴细胞的抑制率。

由于实验室可提供条件有限以及淋巴细胞体外培养时很容易死亡，所以实验数据存在误差，希望在以后的学习研究中可以进一步探索完善实验。

[1] 徐华坤.云南省部分奶源地原奶中黄曲霉毒素M1与饲料中黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的相关性研究[D].昆明医科大学，2013.

[2] 高博，王艳，陈霄，曹云恒，等.贵州省辣椒制品中黄曲霉毒素B1的污染调查[J].贵州农业科学，2012，1（15）：141-142.

[3] 张自强，柏凡，张克英，等.我国饲料中黄曲霉毒素B1污染的分布规律研究[J].中国畜牧杂志，2009，6（12）：27-28.