smad4和cyclinA蛋白在大鼠卵巢颗粒细胞中的表达及当归黄芪超滤膜提取物对其的增殖作用*

赵粉琴，袁爱倩，李娜娜，谢知慧，胡雁云，刘 凯甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000

当归和黄芪是补血益气的常用中药，以黄芪和当归按照5∶1比例组方而成的当归补血汤作为经典方药临床用于补血养血，尤其针对卵巢功能衰退引起的月经量过少甚至闭经的患者，方中重用黄芪大补元气，以资气血生化之源，符合“有形之血生于无形之气的理论”，又配伍当归养血和营，使阳生阴长，气旺血生。颗粒细胞是卵泡的营养细胞，在卵泡发育期间起重要促进作用。临床屡用当归补血汤显著增加月经量，改善卵巢功能，但机制尚不明确。因此，探讨Smad4蛋白和细胞周期蛋白cyclin A在颗粒细胞增殖中的表达以及当归黄芪超滤膜提取物的干预作用，为当归补血汤的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 按照参考文献［1］的方法制备当归黄芪超滤膜提取物：生药煎煮-粗滤-浓缩-微滤-超滤-浓缩-喷干，每克生药含超滤膜提取物干燥粉0.141 g(甘肃省膜科学院提供，将当归黄芪合剂1∶5水提液分离为10万分子量滤过物)。

1.2 大鼠卵巢颗粒细胞的培养及鉴定 从甘肃中医药实验动物中心购买3周龄雌性SD大鼠［实验动物合格证号：SCXK(甘)2011-0012］适应性喂养2天，皮下注射孕马血清促性腺激素(PMSG)40IU，48小时后颈椎脱臼法处死，取出卵巢在无血清DMEM/F12培养基中用1 mL空针针头刺破卵泡，收集颗粒细胞，巴氏管轻轻吹打，200目不锈钢细胞筛过滤。

卵泡雌激素受体(FSHR)表达鉴定细胞：取生长旺盛的第4天的细胞，用0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化，1 000 r/min离心8分钟后弃上清收集细胞，制成2.5×104/mL的细胞悬液，种植于培养板，细胞融合达70%时取出玻片，4%甲醛固定，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞2次。

细胞免疫组化染色：滴加一抗FSHR兔多克隆抗体(1∶200)40℃过夜，滴加 5 mL Annexin V-FITC标记二抗兔免疫球蛋白G(IgG)及4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)工作液，室温避光孵育60分钟；PBS清洗5 min×3次，荧光显微镜下观察拍照。

1.3 大鼠卵巢颗粒细胞增殖率的M TS监测 取生长旺盛的第4天的细胞，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化，1 000 r/min离心8分钟后弃上清收集细胞。显微镜下计数后按2.5×104/mL的细胞悬液，每孔100 μL接种于96孔细胞培养板。DMEM/F12 培养基(含 10%胎牛血清)，37℃，5%CO2培养箱中预培养24小时后见细胞贴壁，换液继续培养。按不同药物浓度处理细胞，每孔培养总体积100 μL，并设置相应的空白组。继续培养24、48、72小时后，37℃水浴10分钟，融化CellTiter96AQueous one solution reagent，在96孔板中，每孔加入20 μL CellTiter96AQueous one solution reagent，37℃，5%CO2环境培养 1～4 小时，490 nm处读取吸光度数。以检测细胞增殖情况。并按下列公式计算细胞增殖促进率：

增殖促进率(%)=(实验组OD值-空白组OD值)/空白组OD值×100%

空白组加入等容量无血清培养基；实验组加入不同剂量当归黄芪超滤膜提取物0.75、0.375、0.1875 g/L，每孔总体积 100 μL，培养 24、48、72小时。每组设5个重复孔。

1.4 sm ad4和cycl i nA蛋白表达水平的W est ern bl ot检测 加入各组培养液继续培养，待各组细胞生长至融合度为90%时取出，细胞刮至瓶底一角，收集至预冷的EP管中，PBS清洗细胞3次，40℃，1 000 r/min离心10分钟，弃上清，加入蛋白抑制剂的RIPA裂解液200μL，并反复吹打10次左右，冰上静置30分钟，再次离心12 000 r/min，40℃，取上清至EP管中(即为所需蛋白提取液)；蛋白变性后每孔上样品20 μL，电泳，转膜3小时，分别加入Smad4和cyclin A一抗370C水浴孵育1小时后40℃过夜，次日二抗37℃水浴孵育1小时，然后暗室中加入ECL发光液，X光胶片曝光30分钟，扫描图像并且分析结果，将目的蛋白与内参β-actin条带的光密度值作比较。

1.5 统计学方法 用SPSS 16.0统计学软件进行分析，计量资料以(±s)表示，采用单因素方差分析，P＜O.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 颗粒细胞形态学 培养24小时后倒置显微镜白光下可见颗粒细胞形态不规则，呈多角形或梭形FSHR鉴定结果：荧光显微镜下通过间接免疫荧光标记的卵巢颗粒细胞的FSHR蛋白被染成绿色，见图1。

图1 颗粒细胞FSH R鉴定结果

2.2 当归黄芪超滤膜提取物对卵巢颗粒细胞增殖的影响(M TS检测) 当归黄芪超滤膜提取物可促进颗粒细胞增殖，其增值与时间及药物浓度相关，尤其在48小时增值最明显，72小时后细胞增殖缓慢；尤以0.375 g/L当归黄芪超滤膜提取物促进细胞增殖最显著，其增殖率在24、48、72小时，光密度值与空白组同一时间点比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 M TS监测当归黄芪超滤膜提取物对卵巢颗粒细胞增殖的影响(±s)

表1 M TS监测当归黄芪超滤膜提取物对卵巢颗粒细胞增殖的影响(±s)

注：＊表示中药2组与其他组比较，P＜0.05

组别 时间24 h 48 h 72 h空白组 0.191±0.291 0.234±0.241 0.206±0.551中药1(0.750 g/L)组 0.191±0.129 0.222±0.434 0.214±0.245中药2(0.375 g/L)组 0.252±0.441* 0.283±0.231* 0.271±0.326*中药3(0.1875 g/L)组 0.172±0.306 0.219±0.221 0.191±0.443

2.3 sm ad4和cycl i nA蛋白表达水平(W est ern bl ot检测) 选取最佳作用浓度和时间段，监测颗粒细胞Smad4和Cyclin A蛋白表达。当归黄芪超滤膜提取物各剂量组对大鼠卵巢颗粒细胞的促进作用在给药48小时时Smad4和Cyclin A蛋白表达最高，中剂量明显高于高剂量和低剂量，且优于空白组，差异有统计学意义(P＜O.05)，见表2、图 2。

表2 颗粒细胞Sm ad4和Cycl i n A蛋白灰度值表达的比较(±s)

表2 颗粒细胞Sm ad4和Cycl i n A蛋白灰度值表达的比较(±s)

注：＊表示中药2组与其他组比较，P＜0.05

组别 Sm ad4 Cycl i n A空白组 0.199±0.002 0.234±0.004中药 1(0.750 g/L)组 0.074±0.004 0.123±0.005中药 2(0.375 g/L)组 0.238±0.005* 0.293±0.006*中药 3(0.1875 g/L)组 0.091±0.008 0.219±0.007

图2 颗粒细胞Sm ad4和Cycl i n A蛋白灰度表达

3 讨论

颗粒细胞是用于研究卵巢细胞增殖、分化和细胞间相互作用及信号转导通路分子机制的理想细胞模型。卵泡发育过程中颗粒细胞的增殖、分化对卵母细胞发育成熟起重要作用［2］。TGF-β信号通路对卵泡的发育、颗粒细胞增殖、分化有重要调控作用，其变化可影响内分泌激素的作用，从而影响卵巢功能［3-4］。Smad4是介导TGF-β信号转导的核心信号蛋白。细胞周期蛋白又称细胞周期素(Cyclins)，是在细胞周期进程中发挥重要作用的一类特殊蛋白质。细胞周期蛋白在调控细胞周期转换过程中起重要作用［5］，其中细胞周期D1(cyclin D1)和细胞周期A(cyclin A)的首要功能主要是促进细胞增殖［6］。柳朝华等［7］研究显示Cyclin促进颗粒细胞的增殖，并在不同生长阶段卵泡颗粒细胞的周期进行中起正调节作用。

黄芪具有抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、抗应激及抗氧化等作用［8-9］。关欣等［10］研究表明当归黄芪超滤膜提取物对氧化损伤起保护作用的途径可能与保护细胞线粒体、提高该细胞抗氧化酶活性、减少过氧化产物的产生、防止氧自由基的产生、促进细胞增殖修复有关。李应东等［11］研究表明当归黄芪超滤膜提取物(当归和黄芪熬制后提取物)具有促进心肌细胞增殖的作用。

本研究结果表明，与空白组同一时间点比较，0.375 g/L浓度的当归黄芪超滤膜提取物在各时间段对大鼠卵巢颗粒细胞的增殖指数差异均有统计学意义(P＜0.05)。同时研究结果表明颗粒细胞Smad4蛋白和Cyclin A蛋白表达明显，而且颗粒细胞增殖越明显，两种蛋白越呈现高表达。

多条信号通路参与颗粒细胞甾体生成的调控及细胞的一系列生命过程。其中TGF-β1/Smad4信号表达途径目前研究最多，本研究推测当归黄芪超滤膜提取物可能通过增加卵泡颗粒细胞Smad4的合成和促进细胞周期蛋白的表达，以促进颗粒细胞增生，从而增加雌激素的合成以及增加卵泡微环境中促进卵母细胞生长和成熟的细胞因子。而当归黄芪提取物是否通过黄芪保护细胞线粒体，同时当归的补血养血作用协同抑制卵巢颗粒细胞的凋亡，这一作用机制有待于进一步研究证实。

卵巢内足量的当归黄芪能促进颗粒细胞正常增殖通道，即TGF-β1/Smad4/cyclin A通道，增强颗粒细胞中Smad4和cyclinA的表达，促进颗粒细胞增殖和卵泡发育，是恢复卵巢功能的主要原因之一。

［1］陈舜华.应用超滤膜精制中药制剂的实验研究［J］.净水技术，2004，23(2):16-17.

［2］HostE，G abri el sen A，Li ndenberg S，eta1.A popt osi s i n hum an cum ul us cel l s i n rel at i on t o zona pel l uci da t hi ckness vari at i on，m at urat i on st age and cl eavage of t he correspondi ng oocyt e aft er i nt racyt opl asm i c sperm i nj ect i on［J］.Fert i lSt eri l，2002，77(3)：511-515.

［3］Ingm an W V，Robert son SA.D efi ng t he act i ons of t ransform i ng grow t h fact or bet a i n reproduct i on［J］.Bi oessays，2002，24(10)：904-914.

［4］Foi j erF，Te RH.Check，doubl e check：t he G 2 harri er t o cancer［J］.Cel l Cycl e，2006，5(8)：831-836.

［5］Pangas SA，Li X，Robert son EJ，et al.Prem at ure l ut eini zat i on and cum ul us cel ldefecti n cel ldefect s i n ovari an-speci fi c Sm ad4 knockout m i ce［J］.M ol Endocri nol，2006，20(6)：1406-1422.

［6］W ang X，M eng X，Sun X，et al.W nt/bet a-cat eni n si gnal i ng pat hw ay m ay regul at e cel lcycl e and expressi on of cycl i n A and cycl i n E prot ei n hepat ocel l i l ar carci nom a cel l s［J］.Cel l Cycl e，2009，8(10):1567-1570.

［7］柳朝华，张惠，何亚平，等.Cycl i nG 1在小鼠卵巢的表达及其与卵泡发育的关系［J］.四川大学学报：医学版，2006，37(6)：893-897.

［8］高学敏.中药学［M］.5版.北京:中国中医药出版社，2007：502-503.

［9］曹祥，钱新华，徐梅佳，等.黄芪多糖和丁酸钠联合用药对K 562细胞胎儿血红蛋白合成的作用［J］.中华实用儿科临床杂志，2011，26(15)：1164-1166.

［10］关欣，李应东，刘凯，等.当归黄芪超滤膜提取物预处理对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤保护作用的研究［J］.上海中医药杂志，2009，43(4)：70-72.

［11］李应东，刘野.当归黄芪超滤膜提取物含药血清对辐射心肌成纤维细胞增殖和胶原的影响［J］.江苏中医药，2010，42(3)：70-71.