武权生教授周期疗法对乳腺增生病模型大鼠ER、PR、ERK的影响*

张小花 ，申 剑，武权生△，苏珊珊

1甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000;2桓台县中医院

武权生教授是甘肃省名中医，在长期医疗实践中积累了丰富的治疗乳腺增生病(hyperplasia of mammary gland，HMG)的经验，在临床上尤其擅长用疏肝散结、补肾柔肝周期疗法治疗HMG［1］。本研究旨在探讨武权生教授周期疗法治疗HMG的作用机制，现将结果报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取SPF级3～4月龄、健康雌性SD大鼠90只，体质量(200±20)g，由甘肃中医药大学动物实验中心SPF级实验室提供，实验动物合格证号：SYXK(甘)2011-0001-62001000000069。

1.2 主要试剂、药品 苯甲酸雌二醇注射液(杭州动物药品厂，批号：140429)；生理盐水(辰欣药业股份有限公司，批号：1206191101)；黄体酮注射液(浙江仙琚制药股份有限公司，批号：130702)；三苯氧胺(扬子江药业集团有限公司，批号：14042911)；逍遥丸(兰州佛慈制药股份有限公司，批号：14A28)；中药(Ⅰ号方药物组成：柴胡、赤芍、枳实、川楝子、夏枯草、白蒺藜、全瓜蒌、鳖甲、王不留行、当归、生地黄、海藻、昆布；Ⅱ号方药物组成：柴胡、醋香附、延胡索、王不留行、川楝子、夏枯草、当归、杭白芍、海藻、昆布、何首乌、菟丝子、肉苁蓉、巴戟天、知母、黄柏)。以上药物均购自甘肃中医药大学附属医院药剂科；兔抗鼠细胞外调节蛋白激酶(ERK)抗体(编号：ZS-940，批号：G0110)，兔抗鼠雌激素受体(ER)抗体(编号：ZS-5420，批号：23546)，兔抗鼠孕激素受体(PR)抗体(编号：ZS-5380，批号：23546)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 实验方法 从90只大鼠中随机抽取20只，为空白组，右下肢肌肉注射生理盐水注射液0.2 mL/(kg·d)，共30天。其余70只大鼠进行造模［2］：大鼠右下肢每日肌注苯甲酸雌二醇注射液0.5 mg/(kg·d)，25天后，改为肌肉注射黄体酮注射液4.5 mg/(kg·d)，共5天。实验第31天随机从造模组和空白组中分别抽取10只大鼠，脱臼处死，楔形取下第3对左侧乳房，置于10%的甲醛溶液中固定，包埋切片，HE染色后在光镜下观察组织形态学变化，观测造模是否成功。造模成功后将60只大鼠按灌服药物不同随机分为6组，每组10只，分别为模型组、逍遥丸组、三苯氧胺组及中药低、中、高剂量组。空白组和模型组给予生理盐水0.2 mL/(kg·d)灌胃，其余5组灌胃药物剂量根据人与动物每公斤体质量剂量换算系数表换算。其中逍遥丸组灌服逍遥丸混悬液0.8 g/(kg·d)；三苯氧胺组灌服三苯氧胺水溶剂3.6 mg/(kg·d)；中药组先灌服Ⅰ号方10天，低、中、高剂量组分别为11.1、22.2、44.4 g/(kg·d)，后灌服Ⅱ号方 20 天，低、中、高剂量组分别为9.6、19.2、38.4 g/(kg·d)。

1.4 观察指标 分别于造模后、灌服Ⅰ号方10天后、灌服Ⅱ号方20天后测量大鼠第3对乳房左侧乳头的直径。末次灌胃24小时后脱臼处死大鼠，无菌操作楔形取下大鼠第3对左侧乳房，用10%中性甲醛溶液固定后分别进行病理切片，免疫组化法检测ER、PR、ERK阳性表达。免疫组化法检测 ER、PR、ERK 阳性表达的判断标准［3］：乳腺的导管及小叶上皮细胞的核和/或胞浆呈现棕黄色着色时判为阳性。未见阳性细胞表达计为(-)；阳性细胞数小于总数的20%，而局部见少量较强着色的阳性细胞计为(±)；若阳性细胞率大于20%，依据阳性细胞的数目由少到多、着色由浅到深依次计为(+)(++)(+++)(++++)。计算阳性率时将(±)计入阳性范围；(-)(±)(+)(++)(+++)(++++)，分别计为0、1、2、3、4、5 分，其积分值越高，则 ER、PR、ERK 含量越高。试验期间所有实验动物分笼饲养，室温24～27℃，相对湿度为 49%～61%，通风良好，标准饲料，自由进食饮水。

1.5 统计学方法 数据采用SPSS 17.0统计软件处理，计量资料以(±s)表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 一般情况 与空白组大鼠相比，造模第12天起其余各组大鼠开始出现喜聚集、毛发粗糙、具有攻击性、乳房色红，造模结束后出现精神不振、爪凉、易激惹、乳房色红、透毛可见；用药后上述表现不同程度好转，活动增加，易激惹、乳房红肿现象基本消失。造模后，各造模组大鼠的乳头直径与空白组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，各造模组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)；灌服Ⅰ号方10天后各用药组大鼠乳头直径缩小，与空白组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，各造模组间比较无明显差异(P＞0.05)；灌服Ⅱ号方20天后大鼠乳头直径进一步缩小，除中药高剂量组外，其余各组与空白组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，各用药组与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 各组大鼠乳头直径变化情况(±s) m m

表1 各组大鼠乳头直径变化情况(±s) m m

注：#表示与空白组比较，P＜0.05；*表示与模型组比较，P＜0.05

组别 只数 造模后乳头直径 灌服Ⅰ方后乳头直径 灌服Ⅱ方后乳头直径空白组 10 0.83±0.13* 0.98±0.14* 0.92±0.09*模型组 10 1.67±0.15# 1.32±0.13# 1.33±0.13#三苯氧胺组 10 1.65±0.18# 1.28±0.09# 1.10±0.08#*逍遥丸组 10 1.67±0.13# 1.36±0.20# 1.14±0.15#*中药低剂量组 10 1.59±0.12# 1.20±0.16# 1.09±0.11#*中药中剂量组 10 1.65±0.22# 1.22±0.16# 1.04±0.08#*中药高剂量组 10 1.58±0.17# 1.26±0.20# 0.90±0.09*

2.2 乳腺组织ER、PR、ERK表达强度 各组大鼠乳腺ER表达积分与模型组比较均较低，其中以空白组、中药中剂量组最为明显，差异有统计学意义(P＜0.05)；除空白组、中药中剂量组外，其余各组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。各组大鼠乳腺PR表达积分与模型组比较降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；除模型组外其余各组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

表2 各组大鼠乳腺组织ER、PR表达积分情况(±s)分

表2 各组大鼠乳腺组织ER、PR表达积分情况(±s)分

注：*表示与模型组比较，P＜0.05

组别 只数 ER PR空白组 10 1.20±0.83* 1.80±0.84*模型组 10 4.00±1.00 4.00±1.00三苯氧胺组 10 2.00±1.22 2.20±1.30*逍遥丸组 10 2.40±0.55 2.40±0.55*中药低剂量组 10 1.80±1.64 1.60±1.34*中药中剂量组 10 1.20±0.45* 1.80±0.84*中药高剂量组 10 2.60±1.81 1.60±0.55*

2.3 乳腺组织ERK表达强度 与模型组比较，各组大鼠乳腺ERK表达积分均降低，其中以空白组、中药高剂量组最明显，差异有统计学意义(P＜0.05)。与三苯氧胺组比较，中药高剂量组ERK表达积分较低，差异有统计学意义(P＜0.05)。其余各组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表3。

表3 各组大鼠乳腺组织ERK积分值(±s) 分

表3 各组大鼠乳腺组织ERK积分值(±s) 分

注：*表示与模型组比较，P＜0.05；△表示与三苯氧胺组比较，P＜0.05

组别 只数 ERK空白组 10 1.90±0.74*模型组 10 3.60±1.17三苯氧胺组 10 2.80±0.79逍遥丸组 10 2.60±0.84中药低剂量组 10 2.10±0.99中药中剂量组 10 2.30±0.48中药高剂量组 10 1.90±0.99*△

3 讨论

HMG是一种非炎非瘤的增生性病变，与内分泌紊乱关系密切，其基本病理变化是乳腺的腺泡、导管及纤维结缔组织的增生［4］。HMG的发病可以从青春期至绝经期的任一年龄，其中以25～45岁多见，35～45岁为高峰年龄，约占全部乳腺疾病的70%以上。中医称其为“乳癖”，冲任失调，肝郁肾虚为发病之本，血瘀气滞痰凝为发病之标，属本虚标实，与肝、脾、肾 3脏［5］密切相关，其症状常在月经前明显加重。

在临床诊疗中，武权生教授依据月经节律冲任、胞宫气血由满盈、溢泻至空虚的变化和本病随月经周期发作的特点而分段周期论治。强调“经前勿补，经后勿泻”的原则，认为经前血海充盈，宜疏导；经后血海空虚，宜调补。因此，针对乳腺增生病在月经的不同时期制定了不同的中药处方：Ⅰ号方重用柴胡疏肝解郁，枳实理气解郁，泄热破结，二者共为君药，疏肝散结为主，一升一降，加强舒畅肝气之功，肝气舒，结块散，乳痛消；川楝子理气止痛，白蒺藜疏肝解郁，二药相伍，疏肝解郁和胃；鳖甲、昆布、海藻软坚散结共为臣药，疏肝解郁，软坚散结；当归、王不留行活血消肿；夏枯草、全瓜蒌散结消肿清热，共为佐使，诸药合用，共奏疏肝清热、软坚散结之效。Ⅱ号方中菟丝子、巴戟天、肉苁蓉补肾阳亦能调补冲任，三者共为君药，肾气健，肝气平，则冲任调；白芍调冲任；当归甘温而润，养血活血，白芍配当归活血调经，养阴柔肝；柴胡、醋香附、川楝子疏肝解郁；知母、黄柏滋肾阴，共为臣药，补肾柔肝，又肝肾同源，肾气肾精充足则肝主疏泄的功能得以更好发挥；海藻、昆布、夏枯草散结消肿；何首乌补益精血，配夏枯草散结消肿；元胡活血化瘀、理气止痛；王不留行活血通经，行血脉，共为佐使，散结消肿，活血止痛；全方共奏疏肝、补肾柔肝、调补冲任之效。两方抓住HMG肝气郁结，痰凝血瘀，冲任失调的病机，配伍精当，根据HMG的病理特点，攻补兼施，标本兼治而不失侧重。

妇女正常乳腺中的雌、孕激素受体高表达与乳腺癌的发病率升高有关［6］，更有学者通过实验发现乳腺组织从正常到增生终至癌变的过程中，ER的阳性表达量呈渐进性［7］。ERK2mRNA在乳腺病中表达由强到弱分别为乳腺癌、非典型增生、良性增生、正常乳腺，说明ERK2在乳腺癌发生的整个过程中为活化状态，与乳腺增生的发病有关［8］。本研究表明，乳腺增生大鼠ER、PR、ERK含量明显升高，而周期治疗可抑制雌、孕激素受体的表达，减弱雌、孕激素对靶细胞的敏感性，从而达到治疗乳腺增生的目的。

［1］陈多珍，武权生.武权生教授运用周期疗法治疗乳腺增生病经验简介［J］.新中医，2011，43(9):135-136.

［2］罗伦才，季小平，黄兰雅，等.均匀设计法用于乳腺增生动物模型复制的研究［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17(7):204-206.

［3］张珺.消核冲剂对乳腺增生病大鼠模型性激素受体及细胞增殖核抗原的影响［D］.合肥：安徽中医学院，2006.

［4］张凤仙，陈林兴.中西医结合治疗乳腺增生病的研究进展［J］.云南中医中药杂志，2007，28(1):43-45.

［5］王非，吴开明.中医对乳腺增生病的认识及实验研究概况［J］.时珍国医国药，2008，19(3):622-623.

［6］陈怡君.乳腺增生中医辨证与ER、PR表达的相关性［J］.现代诊断与治疗，2014，25(8):1726-1728.

［7］魏晓丽，张玉，刘敏丽，等.乳腺癌组织中Survi vi n、K i 67的表达变化及意义［J］.山东医药，2013，53(3):12-14.

［8］范微，李晓夏.桂枝茯苓胶囊配合散结镇痛胶囊治疗乳腺增生临床观察［J］.中国药物经济学，2013，8(7):361-363.