微针对5-氨基酮戊酸经皮渗透的作用研究*

梁齐飞，云健健，杨凤元，黄熙

（桂林医学院附属医院，广西 桂林，541001）

鲜红斑痣（port wine stains，PWS）是皮肤毛细血管的扩张及畸形，对患者容貌影响较大，是临床治疗的难点。光动力疗法（photo dynamic therapy，PDT）近年来应用于PWS的临床治疗，取得一定疗效。PDT根据光敏剂使用方法不同主要分为静脉注射（如血卟啉单甲醚）和局部外用（如5-氨基酮戊酸）等，前者疗效较好，但存在用量大、费用高、代谢慢、治疗后需长时间避光、易引起光敏反应等缺点，限制了临床使用。为避免静脉注射光敏剂的缺点，局部外用5-氨基酮戊酸（5-aminolevulinic acid，5-ALA）光动力疗法已尝试用于PWS治疗，但存在经皮渗透较弱的问题。基于外用药物经皮渗透的最大障碍是表皮角质层的特点，已有研究证实微针作用下表皮角质层的完整性破坏，可使药物经皮吸收增强。为提高5-ALA的经皮渗透性，设想通过微针作用来增加5-ALA渗透。因此本实验开展了微针作用于鸡冠后，5-ALA代谢产生的PpIX在鸡冠组织中的药代动力学研究。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

5-ALA（规格118 mg，复旦张江生物制药有限公司），原卟啉IX（PpIX）（250 mg，Aladdin-阿拉丁试剂上海有限公司），抗荧光衰减封片剂（5 ml，北京索莱宝科技有限公司），皮肤滚针（针长0.25 mm，苏州秀诺光电科技有限公司），荧光分光光度计（RF-5301pc，岛津企业管理中国有限公司），倒置荧光相差显微镜（日本OLYMPUS公司），半微量天平（MS105DU，瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 实验动物

成年雄性莱亨鸡（动物合格证号4104035）24只，体重2.0～2.5 kg。鸡冠厚度8～10 mm，色泽红润，颜色均匀，无溃疡坏死等，实验前口服水合氯醛（2 ml/kg）麻醉。

1.3 实验方法

1.3.1 PpIX在组织内分布 取12只莱亨鸡，随机分为5-ALA组和微针联合5-ALA组，每组6只。鸡冠一侧用亚甲蓝和碘伏标记6块0.6 cm×0.6 cm区域为实验区域，对侧不做处理为自身对照。使用灭菌注射用水配制20%浓度的5-ALA，5-ALA组：实验区域放置等面积纱布2层，将5-ALA溶液滴于纱布上，塑料薄膜封包，锡纸包扎后避光放置；微针联合5-ALA组：鸡冠先用微针滚磨后，将20% 5-ALA涂抹于实验区域，避光放置。两组均在6 h内每h用皮肤环钻切取一块组织做冷冻切片，抗荧光衰减封片剂封片后，倒置荧光相差显微镜下观察PpIX分布，选择黄色激发块（BP545-580，DM600，BA610-1F），明视场对应3号滤光片，曝光指数400，观察放大×200倍图像，并拍照记录。

1.3.2 鸡冠组织PpIX含量 ①标准液的配制及标准方程确定：结合张波等[1]的方法配制标准液。Matlab多项式拟合得出标准方程：y=0.0296X4-0.1450X3+0.2751X2-0.2253X+0.0688；其中X为PpIX荧光强度对数值，y为抽提液PpIX浓度（mg/L），拟合度0.9989，曲线拟合成立。组织PpIX含量（Yt）=y×抽提液体积/组织质量（ng/g）；②另12只莱亨鸡，同样随机分为5-ALA组和微针联合5-ALA组，两组处理与第一步相同，从第2～7 h每h用皮肤环钻切取一块组织，电子天平称重后放入陶瓷研钵内，加入适量液氮碾磨成粉，加入1.0 ml hepes buffer，室温下混匀，再加入1.0 ml hepes buffer，充分混匀后，移入离心试管中，加入5 ml乙酸乙酯：冰醋酸（4∶1）混合液，混匀，转速2 000 r/min离心1 min，以除去蛋白质，取上清液，并加入4 ml 0.5 NHCl，剧烈振摇、混匀，转速2 000 r/min离心1 min，静置，待充分分层后，取下层液体行荧光分光光度计检测。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，测得结果以均数±标准差（±s）表示，不同时间点比较采用重复测量设计的方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PpIX组织内分布

选取第1～6 h每h切取一块鸡冠组织。由于石蜡切片自发荧光强，而且在脱蜡处理中会造成PpIX丢失与荧光淬灭，采用冷冻切片后在倒置荧光相差显微镜下观察PpIX荧光分布。由于表皮层有自发荧光现象，拍摄正常鸡冠组织切片作比较，可观察到正常鸡冠表皮层有微弱的荧光。5-ALA组和微针联合5-ALA组表皮和真皮组织都观察到有弥漫性PpIX荧光分布，真皮中PpIX主要集中在血管组织周围，荧光强度随时间逐渐增强，3～5 h荧光最强，6 h开始减弱，且微针联合5-ALA组荧光强度较5-ALA组高。见图1、2。

2.2 鸡冠组织PpIX含量

图1 部分切片明视场图像和正常对照组图片 （×200）

图2 不同时间PpIX在鸡冠组织内荧光分布 （×200）

根据冷冻切片观察结果，从第3 h开始荧光强度增强，第6 h开始下降，因此选择于第2～7 h切取组织测定PpIX含量。结果显示，PpIX含量随时间增加逐渐增多，第3 h开始增多，第4 h达高峰，第5 h开始缓慢下降。微针联合5-ALA组和5-ALA组第2 ～ 7 h静息状态下产生PpIX含量的比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点间的PpIX含量有差别（F=601.005，P=0.000）；②微针联合5-ALA组与5-ALA组静息状态下相同时间产生PpIX含量有差别（F=36.997，P=0.000），且微针联合5-ALA组与5-ALA组比较每h产生PpIX量更多，说明2种不同处理方法对生成PpIX影响差异有统计学意义；③两组PpIX含量变化趋势有差别（F=6.390，P=0.000），说明时间与处理方法的交互作用差异有统计学意义。见附表、图3。

附表 两组各时间点PpIX含量比较 （±s，ng/g）

附表 两组各时间点PpIX含量比较 （±s，ng/g）

组别 2 h 3 h 4 h 5 h 6 h 7 h 5-ALA 组 151.94±10.33 354.68±5.33 636.27±27.55 530.66±51.91 429.23±24.51 336.02±25.26微针联合5-ALA组 180.88±7.08 389.06±6.36 689.76±41.30 643.67±36.41 470.65±22.41 381.97±8.01

图3 5-ALA组（A）和微针联合5-ALA组（B）PpIX含量不同时间变化趋势

3 讨论

1994年，我国学者吴洋等[2]研究发现鸡冠与人毛细血管瘤组织结构相似，血红蛋白和皮肤光吸收特性也基本相同，因此用鸡冠作为PWS动物模型是可行的。PWS是一种先天性疾病，病理改变为真皮浅层毛细血管扩张畸形。PDT是目前治疗PWS的最佳方法[3]，它对于不同年龄段和不同类型的PWS都显示出很好疗效，且不良反应很少[4]。但是目前PDT治疗PWS常用的静脉用光敏剂血卟啉单甲醚（HMME）存在着用量大、费用高、治疗后需长时间避光、可引起光敏反应[4]等缺点，给患者生活带来不便。

5-ALA是生成亚铁血红素生物合成通路中的PpIX的前体物质。PpIX是一种内源性光敏剂，当暴露于它的作用光谱后，可产生活性氧进而破坏靶细胞。李伟等[5]采用局部注射或静脉注射的方法在鸡冠中测得高水平PpIX聚集，王娇等[6]研究发现外用5-ALA PDT对鸡冠毛细血管有明显损伤，都提示5-ALA可用于PWS的治疗。PDT的效果取决于光、光敏剂和氧3个因素，在光和氧一定的情况下，提高光敏剂效果将会对PDT疗效产生重要影响。因为5-ALA的亲水和有两性离子特性，皮肤渗透存在一些障碍。为提高外用5-ALA的渗透，学者们采用了很多方法，如电离子透入、皮内注射、口服和静脉注射等。皮内注射存在着用量不容易控制和用药不均的缺点，而口服和静脉注射有潜在的副作用[7]。DONNELLY[8]等通过裸鼠模型研究发现，使用微针可以缩短应用时间和需要的5-ALA剂量，而获得皮肤中高水平的PpIX。受其启发，本研究采用微针处理后外用5-ALA的方式，研究5-ALA在鸡冠组织中合成PpIX量的情况，观察是否可促进5-ALA渗透，进而提高PDT疗效。

微针一般是指尖端直径在几十微米以下，长度＞1～2 mm的微型针头。它通过短暂、可逆地破坏皮肤的致密屏障角质层，形成与皮肤垂直的微小通道，有效促进药物的经皮渗透和在特定部位蓄积[9]。通常治疗用的微针阵列长度＜700μm，仅穿透角质层，不会深达神经和血管分布丰富的真皮层，故不会产生疼痛感和出血[10]。李伟泽等[11]研究发现，微针在皮肤上形成的孔道不会促进细菌进入小鼠机体引起感染，也不会引起新生大鼠皮肤损伤的基因异常表达。光镜下清晰显示，微针处理后72 h，角质层受损区会自动且完全修复，故皮肤刺激性短暂、轻微[12]。微针滚磨情况可能是实验的影响因素之一，为了最大程度减少误差，本实验由同一位操作者在相同的环境下（包括温度、湿度等），每只实验动物滚磨相同的次数，用力尽量保持一致。

本实验观察到，5-ALA代谢产生的PpIX主要在表皮层和真皮血管组织中聚集，而PWS治疗的靶组织就是毛细血管，微针联合5-ALA后再使用一定波长激光照射，将会更有效地损伤毛细血管。在实验观察的7 h内，3 h两组PpIX含量开始增多，4 h达高峰，5 h时仍有很高浓度，提示4～5 h是PDT最佳照光时间。且微针联合5-ALA组的PpIX含量与单纯5-ALA组比较，差异有统计学意义，说明5-ALA能够进入完整鸡冠皮肤，而微针作用破坏了角质层的完整性，可以更好的促进5-ALA的渗透。

本实验是微针促进外用光敏剂渗透的初步探索，对于微针联合5-ALA后，选择多少能量及功率密度的激光照射更合适，有待于进一步研究。

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