TAK-242对Aβ25-35诱导大鼠海马神经元损伤的作用及其机制研究

葛宇松，马成永，徐晏雯，林永忠

（大连医科大学附属第二医院 神经内科，辽宁 大连 116023）

社会老龄化日益严重，老年期痴呆的患者逐渐增多，其中阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是其中最常见的痴呆类型。流行病学调查结果显示，我国年龄≥65岁老年人中AD的患病率为3%～8%，并且随着年龄的增长，患病率将逐渐上升[1]。AD主要表现为隐匿起病，不可逆进行性加重的认知功能损伤包括记忆、视空间能力、语言表达能力等领域障碍，以及常伴随的非认知性神经精神症状，其特征性病理学改变是神经元纤维缠结（neurofibrillary tangle，NFT）、大量老年斑（senile plaque，SP）形成及神经元缺失[2-3]，其中SP核心及主要成分为β-淀粉样蛋白（β-amyloid peptide，Aβ）。

近几年中枢神经系统的炎症反应与AD发病机制的紧密联系及相互作用日益受到关注。研究显示，在AD的炎症反应过程中，Aβ可诱导神经细胞表达和释放多种与炎症相关的活性物质，包括白细胞介素1（interleukin-1，IL-1）、IL-6、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）等，加剧神经细胞的退行性变，而抑制炎症反应可以有效缓解Aβ诱导的神经损伤[2，4-5]。Toll样受体 4（toll-like receptor 4，TLR4）信号通路是目前已知的 重要的炎性通路之一，近 来研究也证实TLRs信号通路参与AD的演变过程，且TLR4在Aβ介导的神经毒性作用中具有重要作用[6-7]，而抑制TLR4信号通路可以缓解Aβ介导的炎症反应[8-9]。TAK-242是TLR4的特异性抑制剂，在脑缺血、脑出血及创伤性脑损伤中都起到神经保护作用[10-12]，然而其是否可以抵抗Aβ诱导的神经细胞损伤仍然未知。

本实验通过双侧海马注射聚集态的Aβ25-35复制AD模型，腹腔注射TAK-242进行干预，观察TAK-242的治疗是否可以促进海马神经细胞的存活，以及对大鼠海马组织中TLR4信号通路蛋白及炎症因子表达的影响，从而了解TAK-242的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

健康Wister大鼠共30只，雌雄不限，体重200～250 g，由中国医科大学动物部提供。所有动物按照自然昼夜，自由进食进水，20～25℃、标准大鼠饲料常规饲养。Aβ25-35（用无菌生理盐水将Aβ25-35稀释成5μg/μl，37℃下孵育2 d，使其变为聚集态的Aβ25-35）、二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）购自美国Sigma公司，TAK-242（TAK-242溶于1% DMSO生理盐水溶液，终浓度为0.4 mg/ml）购自美国MCE公司，TLR4多克隆抗体购自武汉三鹰公司，髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）多克隆抗体购自武汉博士德公司，β-肌动蛋白和辣根过氧化物酶标记的IgG抗体购自美国Santa Cruz公司，IL-1β和TNF-α酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自美国R&D公司，其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及模型的复制Wister大鼠随机分为对照组（双侧海马分别注入生理盐水+腹腔注射1% DMSO生理盐水）、模型组（双侧海马分别注入Aβ+腹腔注射1% DMSO生理盐水）和药物组（双侧海马分别注入Aβ+腹腔注射TAK-242/1% DMSO生理盐水），每组10只。将Wister大鼠用10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔麻醉后，颅顶正中切开皮肤，暴露头骨，俯卧位固定于脑立体定向仪上，双侧颅骨分别钻孔，深达硬脑膜。定位：前囟后3.5 mm，中逢左右2.0 mm， 颅骨平面向下2.7 mm，即为海马注射点。模型组和药物组每侧海马注射2μl（10μg）Aβ25-35，并留针5 min，对照组注射相应剂量生理盐水。TAK-242按5 mg/（kg·d）一次性给予大鼠腹腔注射，从海马注射前1天开始至海马注射后7 d结束，对照组和模型组按同样时间注射相应剂量的1% DMSO生理盐水。各组大鼠均于海马注射后7 d处死。

1.2.2 标本采集 ①各组5只大鼠麻醉后迅速开胸，生理盐水灌注心脏后以4%多聚甲醛液灌注至动物四肢变硬，断头取脑，样本置于4%多聚甲醛中固定24 h，以注射针道为中心做冠状切脑，酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋。连续冠状切片，片厚6μm。相邻切片分别作Nissl染色。②各组5只大鼠麻醉后，断头取脑，冰上分离双侧海马组织，-70℃冰箱保存。左侧进行Western blot检测；右侧进行ELISA检测。

1.2.3 NISSL染色 取各组大鼠切面相同的切片，石蜡切片常规脱蜡至水，染色于硫堇-石碳酸30 min，37℃温箱加热。梯度酒精粉色脱水后，二甲苯透明，中性树胶封片。对Nissl染色的结果进行海马锥体神经元计数，即在低倍镜下（×40）确定海马CA3区位置，然后在高倍镜下（×400）连续数2个视野的海马锥体神经元数目，取其均值，每只动物数3张切片，取其均值，为该只大鼠海马CA3区锥体神经元数。

1.2.4 Western blot检测 取保存的冷冻组织，低温提取蛋白，Lowry法测定蛋白浓度。取50μg蛋白上样到10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶，电泳（120 V，1.5 h）。待溴酚蓝进入凝胶底部后，把蛋白质再印迹到硝酸纤维素膜上，封闭，将膜与溶于封闭液中的一抗（兔抗TLR4抗体1∶500、兔抗MyD88抗体1∶300和小鼠抗β-actin抗体1∶300）4℃孵育过夜，洗涤，最后加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶10 000）室温孵育1 h，洗涤后用ECL发光液曝光显影，将蛋白印迹显影图扫描，利用图像分析软件Scion Image对蛋白带进行光密度分析。以β-actin作为内对照，以对照组目的条带与β-actin灰度值比值为1，计算各组目的蛋白相对表达量。作为TLR4和MyD88蛋白的半定量指标。

1.2.5 ELIS A取保存的冷冻组织，用0.01 mmol/L PBS（pH=7.2～7.4），匀浆后4℃离心，取上清，用ELISA检测IL-1β和TNF-α水平，操作按试剂盒说明进行。所有实验均重复3次，取平均值进行比较。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较用单因素方差分析，两两比较用Tukey's检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TAK-242对Aβ25-35诱导大鼠海马CA3区神经元损伤的影响

3组大鼠海马CA3区神经元比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=21.618，P=0.000）。对照组大鼠海马CA3区细胞带无明显受损，神经细胞密集，排列完整。模型组大鼠海马CA3区较对照组神经细胞排列紊乱，细胞带结构丧失，细胞减少明显，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；药物组大鼠较模型组上述表现明显改善，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图 1、2。

2.2 TAK-242对Aβ25-35诱导大鼠海马TLR4和MyD88表达的影响

3组大鼠TLR4和MyD88蛋白表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=53.006和26.129，均P=0.000）。对照组TLR4和MyD88蛋白表达量较低。与对照组相比，模型组TLR4和MyD88蛋白表达升高（P＜0.05），药物组上述指标表达亦高于对照组（P＜0.05）。与模型组相比，药物组TLR4和MyD88表达降低（P＜0.05）。见图 3。

图1 各组大鼠海马CA3区的神经元 （Nissel染色×400）

图2 各组大鼠海马CA3区的神经元比较

2.3 TAK-242对Aβ25-35诱导大鼠海马IL-1β和TNF-α表达的影响

3组大鼠IL-1β和TNF-α的表达水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=51.539和69.299，均P=0.000）。对照组IL-1β和TNF-α的含量较低，与对照组相比，模型组IL-1β和TNF-α表达量升高（P＜0.05）；与模型组相比，药物组IL-1β和TNF-α表达量降低（P＜0.05）。见图 4。

图3 各组海马TLR4和MyD88蛋白的表达

图4 各组海马IL-1β和TNF-α的表达

3 讨论

AD是中枢神经系统原发性退行性疾病，其主要病理特征之一是在大脑皮层和海马出现大量的老年斑，其主要成分是Aβ。在体和离体实验均发现Aβ可以诱导神经元凋亡，氧化应激以及炎症反应等，而炎症反应越来越受到关注。在AD脑内，Aβ1-40/Aβ1-42形成了β折叠的核心片段，发挥毒性作用。而研究证实，Aβ25-35可以产生同样的毒性作用[13]，因此可以应用Aβ25-35作为AD的研究工具。

本实验采用双侧海马注射聚集态的Aβ25-35复制AD模型，采用Nissl染色可见模型组海马CA1区神经细胞带受损，细胞排列紊乱，细胞数减少，由此可见模拟AD脑内Aβ对神经细胞的损伤成功，与既往研究一致[14]。而应用TAK-242治疗的药物组明显改善海马神经细胞的损伤，保护海马神经元抵抗Aβ25-35诱导的神经毒性。

TLR4是膜蛋白家族一员，是非特异性免疫反应中一类重要的模式识别受体，能过激活下游多种信号分子的表达，促进致炎因子如IL-1、TNF-α的释放，其在神经系统炎症反应中具有重要作用。在体及离体实验研究均显示TLR4参与AD的炎症反应，在其发病机制和病理生理过程中发挥重要角色[4]，且抑制Aβ诱导的炎症反应可以起到神经保护作用[5]。

TLR4信号传导通路包括MyD88依赖途径和非MyD88依赖途径，其中MyD88依赖性途径主要介导促炎细胞因子的表达，在传递上游信息和疾病发生发展中具有重要作用[15]。TLR4活化后与MyD88结合，依次激活下游信号分子IL-1受体相关激酶、肿瘤坏死因子受体相关因子6，最终激活NF-κB信号传导途径，启动细胞因子（如IL-1、TNF-α等）的转录、翻译，致使炎症因子大量释放[16]。 IL-1β具有多种细胞活性，如细胞增殖，分化和凋亡，并且在脑内高表达。其可以引起APP表达增多，加重Aβ的沉积和Tau磷酸化水平[17]。TNF-α是诱导炎症反应和诱导免疫调节过程中的一个重要因子，通过调节细胞因子的级联反应，导致神经元死亡并促进淀粉样前体蛋白（amyloid pre cursor protein，APP）和Aβ的产生[5]。此外，炎症因子可通过上调APP蛋白水解酶β-分泌酶和γ-分泌酶的表达活性来增加脑内Aβ产生和沉积[18]。由此推断，Aβ和炎症因子间形成一个恶性循环，加重AD脑内的病理变化。

本实验结果显示，Aβ可以引起大鼠海马组织TLR4、MyD88蛋白，以及IL-1β和TNF-α表达增高，而TAK-242降低Aβ诱导的上述蛋白表达变化。结合Nissl染色结果可以得出，TAK-242作为TLR4特异性抑制剂可以通过下调TLR4/MyD88信号通路，减少IL-1β和TNF-α炎症因子的释放，从而起到神经保护作用。此外，TAK-242目前已经应用于脓毒症的临床2期实验研究中，在人体中具有良好的安全性[19]，这为AD的治疗提供新的思路，并可能带来治疗方法的新进展。

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