透明质酸钠可溶微针的制备及性能特征*

周 俊，胡 犇，戢力维，冯 露，杨 林△

（1.四川大学华西医院药剂科，四川 成都610041；2.四川大学华西医院线粒体与代谢实验室，四川 成都 610041）

微针技术近年来发展迅速，已引起医学领域的广泛关注。微针结合了注射剂和透皮贴剂的优点，可做到无痛、精确、微创、快速、方便地给药［1−2］，根据功能分为固体微针、中空微针、涂层微针、水凝胶微针、可溶性微针五大类［3−4］。聚合物的机械性能和生物相容性均较好，可在体内降解，不会引起机体的免疫反应，可根据不同强度和功能制作符合条件的微针［5］。透明质酸钠（SH）是透明质酸（HA）的钠盐，是构成人体细胞的重要组成部分［6］。纯HA制备的微针，硬度大，易脆，易断针，且不易脱模［7］。复合HA微针柔韧性相对较好，采取真空注模和真空干燥的方法制备的微针成型效果一般，仍有断针、空针现象，且制备的微针为缓释微针［8−9］。HA微针的制备工艺需摸索制备条件，有制备工艺采取真空注模方式，真空20 min，常温干燥24 h，微针制备耗时较长，且真空设备要求较高，在无真空设备条件下，摸索离心注模的方式和适宜的干燥方法可缩短微针制作时间，制备速溶微针。相较于HA的稳定性差、自由基敏感、机械强度差，SH的力学强度和稳定性均增强［10］。SH的可降解性和生物相容性均好，进入皮肤不会引起炎性反应。查阅文献，目前尚无针对SH的离心注模方法，根据文献中其他基质的离心注模方式：离心机4 000 r/min离心10 min［11］或3 000 r/min离心30 min［12］，SH基质全部脱离模具，进入EP管底部，无法填充模具，需寻找适合SH基质的微针制备方法。本研究中以SH为可溶性微针的基质，筛选了SH微针的最佳制备工艺，并考察了微针的机械性能和体内溶解性能，开发出一种机械性能好、可生物降解的速溶微针，为后期可溶性载药速溶微针的开发奠定基础。现报道如下。

1 仪器、试剂与动物

1.1 仪器

XTL−165型体视显微镜（凤凰光学股份有限公司）；VORTEX 3型漩涡混匀器（艾卡<广州>仪器设备有限公司）；ST16R型高速离心机、Heratherm OMS100通用型烘箱（赛默飞世尔科技<中国>有限公司）；EVO 10型小型扫描电子显微镜（Carl Zeiss AG）；SY−2230型恒温水浴摇床（美国精骐有限公司）；Integra 10型超纯水机（成都宝赛思科技有限公司）；聚二甲基硅氧烷（PDMS）微针模具（台州微芯医药科技有限公司，模具编号为Y19，针高600 µm，15×15阵列）；100 µL移液枪、1 000 µL移液枪（法国Gilson公司）；PM−996型Parafilm封口膜（美国Poli Science公司）。

1.2 试剂

SH［相对分子质量（Mr）为200 000～400 000、批号为20121746，Mr为10 000～100 000、批号为20190107），购自华熙福瑞达生物医药有限公司；水为超纯水。

1.3 动物

SPF级C57BL6/J小鼠，雄性，8～10周龄，体质量为22～24 g，购自成都达硕实验动物有限公司，生产许可证号为SCXK（川）2020−030；饲养于标准清洁级环境，昼夜交替光照（12 h/12 h），标准饮食，自由进食、饮水。本研究符合美国国立卫生研究院《实验室动物使用指南》规定，并通过四川大学实验动物伦理委员会审查。

2 方法与结果

2.1 SH溶液制备

取10 mL超纯水，置15 mL塑料离心管中，缓慢加入称量的SH，漩涡1 min，放入恒温摇床（37℃，1.0 h），SH完全溶解，离心（4 500 r/min）1 min，除去气泡，放入4℃冰箱保存，备用。按上述方法分别配制Mr为10 000～100 000和200 000～400 000的10%SH溶液。

2.2 微针制备

用移液枪吸取100µL配制好的SH溶液，作为微针针尖部分，均匀平铺在聚二甲基硅氧烷微针模具上，放入离心机离心，使SH溶液填满微针模具针孔，再吸取400 µL配制好的SH溶液，作为微针基底部分，均匀平铺在微针模具上。待微针完全干燥后脱模，即得。

2.3 针尖基质和离心条件筛选

将铺好SH溶液的微针模具放入离心机，设置离心温度为4℃，转速为4 200 r/min，调节每次离心时间、离心次数、针尖部分基质，观察微针填充完整度、有无气泡，筛选离心填充微针的最佳条件。筛选结果为针尖部分基质选取10%SH（Mr为200 000～400 000），离心温度4℃，转速4 200 r/min，离心3次，每次30 s，可得到填充完好的微针。针尖基质和离心条件筛选结果见表1。

2.4 基底基质和干燥条件筛选

将针枪填充完整并加入基底溶液后，置40℃恒温干燥箱中干燥，调节基底部分基质和干燥时间（见表2）。观察干燥情况，根据针形、表面平整度选取最佳条件。由图1可知，基底基质选取10%SH（Mr为200 000～400 000）干燥效果不好，片基弯曲严重（见图1 A和图1 B1），针尖被拉伸严重（见图1 B2）；基底基质选取10%SH（Mr为10 000～100 000）干燥均匀，片基平整（见图1 C1），针尖成型良好（见图1 C2）。根据图1和表1，筛选出最佳条件：基底部分基质选取10%SH（Mr为10 000～100 000），干燥温度40℃，干燥2.0 h。

表1 微针针尖基质和离心条件筛选Tab.1 Screening of microneedle matrix and centrifugal conditions

表2 基底基质和干燥条件筛选Tab.2 Screening of basal matrix and drying conditions

2.5 微针视觉形态评价

按最佳方法制备SH微针，分别通过视觉直观、光学显微镜、扫描电镜进行观察，详见图2。制备的SH微针呈圆锥形，根据扫描电镜图上的比例尺可大致得出每根微针高度约600 µm，基部宽度为260 µm，针尖成型良好，针型完整，无气泡，无拉伸现象，SH微针呈白色透明状，整体上无空针、断针现象。

A.基底基质为10%SH（Mr为200 000～400 000）、干燥2.0 h、微针未取下模具的正面B1−B2.基底基质为10%SH（Mr为200 000～400 000）、干燥2.0 h、微针未取下模具的侧面及微针局部放大C1−C2.基底基质为10%SH（Mr为10 000～100 000）、干燥2.0 h、微针的正面直观及微针局部放大图1不同基底基质干燥2.0 h后SH微针直观图A.The front image of the microneedle with basal matrix of 10%SH（Mr is in the range of 200 000−400 000）and drying for 2.0 h before it is removed from the mold B1−B2.The side image and partial enlargement image of the microneedle with basal matrix of 10%SH（Mr is in the range of 200 000−400 000）and drying for 2.0 h before it is removed from the mold C1−C2.The front image and partial enlargement image of the microneedle with basal matrix of 10%SH（Mr is in the range of 10 000−100 000）and drying for 2.0 hFig.1 Horizontal images of SH microneedles with different basal matrixs after drying for 2.0 h

A.刺入小鼠腹部皮肤B−E.刺入小鼠皮肤后1，3，5，10 min时的针尖溶解状态图4 SH微针体内溶解试验结果A.Microneedles pierced the abdominal skin of the mouse B−E.Dissolution state of microneedles at 1，3，5 and 10 min after penetrating into mouse skinFig.4 Results of the in vivo dissolution test of SH microneedles

A.正面直观图B.光学显微镜图C.扫描电镜图图2 SH微针视觉形态A.Front image B.Optical microscope image C.Scanning electron microscope imageFig.2 Visual morphology of SH microneedles

A.封口膜背面（未取出封口膜上的微针）及局部放大B.封口膜正面（取出封口膜上的微针）图3 SH微针封口膜穿刺试验结果A.Backside image and partial enlargement image of the parafilm（microneedles on the parafilm has not been removed）B.Front image of the parafilm（microneedles on the parafilm has been removed）Fig.3 Results of the puncture test of SH microneedle parafilm

2.6 微针机械性能测试

采用封口膜穿刺试验，考虑到皮肤具有弹性，故选用3层Parafilm封口膜模拟皮肤。Parafilm封口膜叠加的层数代表不同厚度的皮肤，本研究中以拇指用一定的力度，将微针垂直按压在封口膜上3 min后，显微镜下观察微针是否穿过封口膜和穿过封口膜的微针数，评价微针的机械性能。微针针尖清晰可见，详见图3。

2.7 体内溶解试验

取C57BL6/J小鼠腹部皮肤脱毛，取按最佳方法制备的SH微针，拇指以一定力度按压，将SH微针垂直刺入皮肤，分别于1，3，5，10 min时拔出SH微针，并观察其在体内的溶解状态。由图4可知，制备的SH微针能穿破小鼠皮肤，且刺入皮肤10 min后的针体完全溶解；根据不同时间段拔出的SH微针针尖可以看出，微针插入皮肤无断针，柔韧性好，不易断裂。

3 讨论

3.1 针尖基质选择

10%SH（Mr为10 000～100 000）针 尖 基 质 较10%SH（Mr为200 000～400 000）的黏度低，流动性强，离心过程中容易脱模而进入塑料离心管底部，填充效果差，故选取黏度相对更大、流动性相对更低的10%SH（Mr为200 000～400 000）作为针尖基质，填充效果好。且以10%SH（Mr为200 000～400 000）作为针尖基质制备的微针，针型完整，能100%脱模，无断针、空针现象；针尖强度良好，能穿破皮肤，相较于纯HA微针，SH微针插入体内无断针，柔韧性好，不易断裂；相较于复合HA微针，SH微针在体内10 min即可快速溶解，制备载药微针可达到快速释药的目的；若装载缓释微球，可制备快速溶解的缓释微针，且微针不用一直贴于皮肤表面，微针溶解后即可取下贴于皮肤表面的微针基底。仅需制备SH 1种基质即可，相较于复合基质，减少了药物与基质间的相互作用，SH溶液配制简便，耗时短，条件易控。

3.2 基底基质选择

10%SH（Mr为200 000～400 000）基底基质在40℃下干燥，容易翘边，针尖部分还未干燥就已被拉伸，造成针尖成型差，不利于微针的制备，可能是SH（Mr为200 000～400 000）分子质量过大，微针受热不均匀造成。故选取分子量相对更小的10%SH（Mr为10 000～100 000）作为基底基质制作微针，得到片基平整、针尖成型良好的SH微针。

3.3 制备工艺

针尖填充：温度4℃，离心转速4 200 r/min，离心3次，每次30 s。相较于其他针尖填充方法，如离心转速4 000 r/min、离心10 min［11］，转速3 000 r/min、离心30 min［12］，真空注模真空20 min［13］，超声注模超声30 min［13］，设备要求简单，操作简便，耗时短，填充效果较好。筛选的干燥方法：恒温干燥，温度40℃，干燥2.0 h。相较于其他微针干燥方法，干燥器干燥24 h［12，14−15］，本研究中筛选的方法简单，耗时短，干燥效果较好。

3.4 后期载药

本研究中制备的是空白微针，SH微针可快速溶解释药，溶解时间为10 min。后期可装载药物制备载药微针，装载可溶性药物，制备可溶性微针，可在刺穿皮肤后达到快速释药的效果；装载缓释微球，制备的微针可在刺穿皮肤时快速释放微球，微球在体内又可缓慢释药，同时可起到缓释给药的作用，且微针不用一直贴于皮肤表面。

3.5 制备方法评价

该微针制备工艺仅需离心机和烘箱即可，操作简单，且微针制备耗时短，短时间内可制备多批次。制得的微针针型完整，100%脱模，无断针、空针现象；针尖韧性好，可刺穿皮肤，溶解快速。制备条件温和，制备过程中温度维持在4～40℃，利于载药过程中药物保持稳定，为后续可溶载药微针和中药载药微针的开发奠定了基础。