APTO-253对紫杉醇或顺铂处理的卵巢癌SKOV3及OVCAR3细胞凋亡及细胞周期的影响

王宝金，申爱荣，付喜玲，李 霞，王新月，任琛琛

郑州大学第三附属医院妇科 郑州 450052

目前肿瘤切除术及术后辅以铂类药物(顺铂)联合紫杉醇为主的基础化疗是标准的卵巢癌治疗方法。但是因卵巢癌起病隐匿，大多数患者确诊时已是晚期；并且该病极易发生浸润、转移，手术难以根除，术后易复发。APTO-253在美国已经被批准应用于一些实体肿瘤的Ⅰ期临床试验。既往的研究[1]证实APTO-253在人类结肠癌、白血病、肾癌和前列腺癌等癌细胞系中具有抗肿瘤细胞增殖活性的作用，能够阻滞细胞周期、促进细胞凋亡。为了了解小分子诱导剂APTO-253在卵巢癌细胞中对化疗药物疗效的影响，作者观察了APTO-253对紫杉醇或顺铂处理的SKOV3及OVCAR3细胞凋亡及细胞周期的影响，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1细胞、试剂及仪器卵巢癌细胞株：自美国菌种中心购买的SKOV3和OVCAR3细胞株。主要试剂：紫杉醇、顺铂购于美国Sigma公司；胎牛血清购于美国HyClone公司；Caspase-3/7试剂盒购于美国Promega公司；P21、cMyc、CDK6、剪切后的聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(Cleaved-PARP)、剪切后的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved-Caspase-3)一抗抗体均购于美国Cell Signaling公司，二抗抗体均购于美国Santa Cruz公司。Western blot蛋白印迹转膜仪购于美国伯乐公司，蛋白印迹电泳仪购于美国英杰公司；荧光免疫显微镜购于日本尼康公司。

1.2细胞培养取出细胞冻存管，分别将完全溶解的SKOV3和OVCAR3细胞(各1 mL)加入3 mL含有体积分数10%已灭活胎牛血清和100 U/mL青霉素及100 mg/L链霉素的DMEM培养液中培养。

1.3SKOV3和OVCAR3细胞凋亡及Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase-3蛋白表达水平的检测取对数生长期的SKOV3和OVCAR3细胞种植于96孔板中，8 000个/孔，设3个复孔，体积分数10% DMEM完全培养液培养过夜，细胞饥饿后，分别加入5 μmol/L APTO-253、4 mg/L顺铂或40 nmol/L紫杉醇、5 μmol/L APTO-253联合4 mg/L顺铂或40 nmol/L紫杉醇的无血清DMEM培养液，采用Caspase-3/7活性方法检测细胞凋亡情况，结果以荧光强度表示。6孔板培养SKOV3和OVCAR3细胞，分组及处理方法同上，提取总蛋白，测定蛋白浓度并配平及变性，进行电泳、电转膜、封闭液封闭、一抗(Cleaved-PARP和Cleaved-Caspase-3)及二抗(兔抗人)孵育、显色曝光，分析SKOV3和OVCAR3细胞Cleaved-PARP及Cleaved-Caspase-3蛋白表达水平。

1.4APTO-253处理后SKOV3和OVCAR3细胞周期及细胞周期相关蛋白(P21、cMyc、CDK6)表达水平的检测用6孔板培养SKOV3和OVCAR3细胞，饥饿24 h，用含5 μmol/L APTO-253的无血清DMEM培养细胞24 h，取2×106个细胞悬浮于5 mL PBS中，离心后重悬细胞。转移细胞悬液至含体积分数70%乙醇的离心管中离心后，于5 mL PBS中悬浮沉淀细胞，等待60 s，离心5 min。在1 mL PI染色溶液中悬浮沉淀细胞，在室温下孵育30 min，流式细胞仪检测细胞周期。在SKOV3和OVCAR3细胞中分别于含5 μmol/L APTO-253的无血清DMEM培养液处理细胞的不同时间点(0、1、3、6、12、24 h)收集、裂解细胞，测定蛋白浓度并配平及变性，进行电泳、电转膜、封闭液封闭、一抗(P21、cMyc、CDK6)和二抗(兔抗人及鼠抗人)孵育、显色曝光，分析细胞周期相关蛋白P21、cMyc、CDK6的表达水平。实验重复3次。

1.5统计学处理实验数据采用SPSS 21.0进行分析。不同处理组间SKOV3、OVCAR3细胞凋亡情况的比较采用析因设计的方差分析；空白对照组和APTO-253组间细胞周期的比较采用两独立样本的t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1APTO-253联合化疗药物紫杉醇或顺铂处理后SKOV3和OVCAR3细胞凋亡及Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase-3蛋白表达的检测SKOV3和OVCAR3细胞凋亡检测结果见表1、2，Cleaved-PARP和Cleaved-Caspase-3蛋白表达情况见图1。

表1 APTO-253和紫杉醇单独及联合处理后SKOV3、OVCAR3细胞凋亡情况的比较(n=3)

SKOV3细胞：FAPTO-253=237.671，F紫杉醇=479.768，F交互=237.671，P均<0.001；OVCAR3细胞：FAPTO-253=84.439，F紫杉醇=910.963，F交互=20.944，P均<0.001

表2 APTO-253和顺铂单独及联合处理后SKOV3、OVCAR3细胞凋亡情况的比较(n=3)

SKOV3细胞：FAPTO-253=124.026，F顺铂=667.161，F交互=50.658，P均<0.001；OVCAR3细胞：FAPTO-253=256.013，F顺铂=14 819.557，F交互=138.311，P均<0.001

2.2APTO-253诱导后SKOV3和OVCAR3细胞周期、细胞周期相关蛋白(P21、cMyc、CDK6)表达的检测APTO-253处理后SKOV3和OVCAR3细胞周期的变化见表3、4。可知，APTO-253可导致G1期阻滞，S期和G2/M期细胞减少。不同时间点细胞周期相关蛋白(P21、cMyc、CDK6)表达水平的检测结果见图2。可知，随着作用时间的延长，细胞周期相关蛋白CDK6和cMyc表达水平下降，而P21蛋白表达水平升高。

1：空白组；2：5 μmol/L APTO-253组；3：40 nmol/L紫杉醇组；4：5 μmol/L APTO-253联合40 nmol/L紫杉醇组；5：4 mg/L顺铂组；6：5 μmol/L APTO-253联合4 mg/L顺铂组图1 APTO-253、紫杉醇(或顺铂)及 两者联合处理后SKOV3和OVCAR3细胞 Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase-3表达的检测

表4 APTO-253诱导后OVCAR3细胞周期的改变 %

图2 APTO-253诱导后不同时间点 SKOV3和OVCAR3细胞周期相关蛋白表达的检测

3 讨论

卵巢癌易早期侵袭转移，易复发，且对化疗药物耐药，病死率位于女性生殖系统肿瘤首位。目前卵巢癌的发生发展机制尚不明确，因此如何增强卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性，提高治疗效果及患者的生存率和生活质量，逐渐成为人们研究的热点。APTO-253是一种小分子化合物，在美国已经被批准应用于一些实体肿瘤的Ⅰ期临床试验[1]。

Cleaved-Caspase-3是活化的Caspase-3被剪切后产生的活性片段，其表达情况可真实反映机体Caspase-3的活性状态及细胞凋亡情况。有学者[2]报道，在直肠癌中高水平Cleaved-Caspase-3的患者预后较好，Cleaved-Caspase-3低水平与直肠癌的复发有关。Donato等[3]研究结果显示，宫颈癌组织中Cleaved-Caspase-3阳性表达率下降；进一步的研究[4]发现Cleaved-Caspase-3表达水平与宫颈癌组织分化程度有关，即其表达随着组织分化程度的增加而明显降低。Cleaved-PARP执行细胞凋亡的功能[5]，是细胞凋亡的生物学标志。王莹等[6]探讨了硼替佐米诱导VSMC凋亡的机制，结果发现在不同浓度药物干预下Pro-Caspase-3表达降低而Cleaved-PARP表达升高。本研究中采用Caspase-3/7活性方法检测细胞凋亡情况，采用Western blot方法检测Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase-3的表达水平，结果显示在SKOV3和OVCAR3细胞中，与空白对照组相比，经APTO-253诱导后细胞凋亡增加，Cleaved-Caspase-3、Cleaved-PARP的表达明显增高，说明APTO-253可促进细胞凋亡；经APTO-253联合化疗药物处理后细胞凋亡显著增加，Cleaved-Caspase-3、Cleaved-PARP的表达明显增高，表明APTO-253可协同增强化疗药物诱导的细胞凋亡，提高卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性。

细胞周期的异常调控使细胞的生长发生紊乱，是导致肿瘤发生的原因之一[7]。本研究结果显示，经APTO-253诱导的SKOV3和OVCAR3细胞中G1期细胞受到阻滞，S期和G2/M期细胞显著减少。CDK6被认为是一种癌基因[8]，参与诱导肿瘤细胞的增殖[9-10]。有学者[11]报道CDK6在上皮性卵巢癌组织中表达升高。作者发现在卵巢癌细胞中APTO-253可下调CDK6的表达，从而抑制细胞增殖，且具有时间依赖性。cMyc是常见的控制细胞增殖和分化的原癌基因，研究[12]发现在浆液性卵巢腺癌及FIGO Ⅲ期以上卵巢癌组织中cMyc过度表达，提示cMyc可能与卵巢癌的发生及发展密切相关。本研究结果显示在卵巢癌细胞中经APTO-253诱导后cMyc的表达明显下调，表明APTO-253可以抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。p21是一种抑癌基因，在卵巢上皮性癌组织中的表达降低，与组织学分级、转移情况、肿瘤大小相关[13-14]，且与FIGO分期密切相关[15]。本研究结果显示，在卵巢癌细胞中经APTO-253诱导后P21表达水平升高。总之，APTO-253可以阻滞卵巢癌细胞周期，抑制细胞生长，并具有时间依赖性。

综上所述，在SKOV3和OVCAR3卵巢癌细胞中APTO-253能够导致细胞周期阻滞，促进细胞凋亡，提高癌细胞对化疗药物的敏感性，联合顺铂及紫杉醇使用有协同作用，能增强化疗药物的疗效。作者推测，APTO-253联合化疗药物可能是治疗卵巢癌的新策略，将促进卵巢癌治疗临床试验的转变。

[1] CERCEK A,WHELER J,MURRAY PE,et al.Phase 1 study of APTO-253 HCl, an inducer of KLF4, in patients with advanced or metastatic solid tumors[J].Invest New Drugs,2015,33(5):1086

[2] NOBLE P,VYAS M,AL-ATTAR A,et al.High levels of cleaved caspase-3 in colorectal tumour stroma predict good survival[J].Br J Cancer,2013,108(10):2097

[3] DONATO AL,HUANG Q,LIU X,et al.Caspase 3 promotes surviving melanoma tumor cell growth after cytotoxic therapy[J].J Invest Dermatol,2014,134(6):1686

[4] MAO P,SMITH L,XIE W,et al.Dying endothelial cells stimulate proliferation of malignant glioma cells via a caspase 3-mediated pathway[J].Oncol Lett,2013,5(5):1615

[5] SHALINI S,DORSTYN L,DAWAR S,et al.Old, new and emerging functions of caspases[J].Cell Death Differ,2015,22(4):526

[6] 王莹,魏会丽,孙瑞红.硼替佐米对人脐动脉血管平滑肌细胞凋亡及Caspase-3表达的影响[J].实用医学杂志,2016,32(19):3155

[7] KOLLMANN K,HELLER G,SCHNECKENLEITHNER C,et al.A kinase-independent function of CDK6 links the cell cycle to tumor angiogenesis[J].Cancer Cell,2013,24(2):167

[8] KOHRT D,CRARY J,ZIMMER M,et al.CDK6 binds and promotes the degradation of the EYA2 protein[J].Cell Cycle,2014,13(1):62

[9] KAWASAKI Y,KOMIYA M,MATSUMURA K,et al.MYU, a target lncRNA for Wnt/c-Myc signaling, mediates induction of CDK6 to promote cell cycle progression[J].Cell Rep,2016,16(10):2554

[10]ZHU K,LIU L,ZHANG J,et al.MiR-29b suppresses the proliferation and migration of osteosarcoma cells by targeting CDK6[J].Protein Cell,2016,7(6):434

[11]凌晨,刘蜀,王勇,等.CDK6在早期卵巢癌中表达及其临床意义[J].南方医科大学学报,2016,36(9):1271

[12]NESBIT CE,TERSAK JM,PROCHOWNIK EV.MYC oncogenes and human neoplastic disease[J].Oncogene,1999,18(19):3004

[13]秦瑞,刘俊宝,曹璐,等.卵巢上皮性癌组织中P21蛋白的表达及其临床意义[J].吉林大学学报(医学版),2012,38(1):98

[14]刘伟,刘海燕,许喆菲,等.p21WAF1基因与卵巢癌临床病理特征的相关性研究[J].陕西医学杂志,2012,41(1):102

[15]张军,汪瑞雪,樊晓妹,等.卵巢浆液性腺癌中SP1、KLF4和p21表达及其预后意义[J].临床与实验病理学杂志,2017,33(1):22