食管癌“环境-遗传-基因互作”组学研究：核黄素、核黄素转运基因2和NOTCH1-P53-Rb互作关系

王立东，杜丹凤，宋 昕，赵学科，胡守佳，周福有，毛伟敏，李秀敏

1)郑州大学第一附属医院河南省食管癌重点开放实验室 郑州 450052 2)郑州大学基础医学院病理学教研室 郑州 450001 3)安阳市肿瘤医院胸外科 河南安阳 455000 4)浙江省肿瘤医院胸外科 杭州 310022 5)新乡医学院癌症研究中心 河南新乡 453003

本研究组利用全基因组关联分析和全基因组外显子测序技术发现核黄素转运基因2(riboflavin transporter gene 2, RFT2；又称C20orf54、SLC52A2、RFVT3)是食管鳞状细胞癌(简称鳞癌)重要易感基因[1]，NOTCH1基因突变是食管癌变的重要分子事件[2]。这些发现引发学者对RFT2和NOTCH1与肿瘤发生和发展的关系进行深入研究。最新研究[3]发现：RFT2不仅是一个重要的易感基因，可能还是一个重要的致病基因；由于核黄素缺乏而引发的RFT2变化和RFT2变异而引起的核黄素利用障碍等又进一步诱导食管癌变多阶段演进密切相关的NOTCH1和P53-Rb通路发生改变[2,4]。这些分子变化不但揭示“环境(核黄素)-遗传(RFT2)-基因(NOTCH1-P53-Rb)互作”模式对阐明食管癌变分子机制的理论意义，同时也为食管癌高危人群分子分型，并进一步建立针对中国人、符合国情的规范化高危人群预警筛查及个体化防治指南提供重要理论依据和技术支撑。本文就这一领域最新进展，特别是“环境(核黄素)-遗传(RFT2)-基因(NOTCH1-P53-Rb)互作”变化关系做简要阐述。

1 核黄素缺乏与食管鳞癌

显著的地域性分布差异(高、低发区发病率相差500倍)和明显家族聚集现象(家族史阳性患者占40%)是中国人食管癌显著的流行病学特征，提示环境和遗传因素在食管癌发生中的重要性。我国老一代科学家对河南、河北和山西三省交界的太行山食管癌高发区人群研究[5-13]发现：维生素缺乏(特别是核黄素、维生素A和叶酸等)和亚硝胺暴露是中国人食管鳞癌发生的主要因素。核黄素是一种水溶性维生素，又称维生素B2，是黄酶类辅基的重要组成部分。在生物氧化还原中，黄酶起传递氢离子的重要作用。核黄素的重要生物学激活形式有2种，即黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，FAD)和黄素单核苷酸(flavin mononucleotide，FMN)(图1)[14]。

图1 核黄素分子结构图

核黄素不能自身合成，只能依赖膳食补充。核黄素在各类食品中广泛存在，但通常动物性食品和绿叶蔬菜及豆类含量较多。有关核黄素与食管癌关系的重要发现包括以下几方面。①食管癌高发区人群研究：食管癌高发区人群核黄素缺乏明显，特别值得指出的是，高发区15～26岁人群也出现明显的核黄素缺乏[13]，且核黄素缺乏的人群食管癌前病变发生率明显升高[6-7,10,15-16]。将核黄素加到食盐中(俗称黄盐)，可作为膳食核黄素补充的重要方法。在食管癌高发区河南的林州、河北的磁县和四川的盐亭地区进行数十年干预研究发现，长期膳食补充核黄素能够降低食管癌前病变和癌的发生率[9,17-26]，这一现象也见于其他国家食管癌高发区[15-16,27-28]。②食管癌与癌旁正常组织：食管癌组织核黄素水平明显低于正常组织[29-30]，核黄素缺乏能明显增加食管癌复发和预后差的风险[31]。③动物模型和细胞系：核黄素缺乏大鼠经甲基苄基亚硝胺处理后，食管癌发生率显著高于核黄素正常组；食管癌细胞系能够重复验证高发区人群的观察结果：用喂饲食管癌高发区四川盐亭居民饮食的大鼠血清处理人食管癌细胞系，发现可明显促进细胞增殖，并能明显诱导CyclinD1和CDK4蛋白及mRNA高表达，而P16和Rb呈现低表达，补充包括核黄素的复合维生素能够逆转上述改变[32-33]。综上，核黄素缺乏是食管癌发生的重要危险因素。

2 RFT2与食管鳞癌发生风险

2.1核黄素转运基因的分类和命名[14]人核黄素转运基因家族目前克隆有3种基因类型，即核黄素转运基因1、RFT2和核黄素转运基因3，分别定位于染色体17p13.3、20p13和8q24.3。这3种跨膜转运基因与目前已知的溶质载体家族(solute carrier family，SLC)成员均不相同，2017年12月被命名为SLC新成员，并分别命名为SCL52A1(核黄素转运基因1)、SCL52A2(RFT2)和SCL52A3(核黄素转运基因3)(详见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/113278)。核黄素转运基因1和RFT2基因序列和功能相似。而自2010年首次发现RFT2与食管鳞癌高发病风险相关以来，有关RFT2与肿瘤关系的研究受到广泛关注。

2.2RFT2与食管鳞癌发生风险[14]RFT2又称 BVVLS、RFVT3、hRFT2、BVVLS1、C20orf54、bA371L19.1、SLC52A2，包含5个外显子，编码51 000跨膜蛋白(含469个氨基酸)，主要负责核黄素跨膜转运。Wang等[1]对2.5万例中国汉族食管鳞癌和对照人群全基因组的关联分析和验证发现2个中国人群食管鳞癌重要易感位点，即rs2274223和rs13042395。这2个位点分别定位于10q23的PLCE1基因和20p13的C20orf54基因。进一步的验证发现这2个SNP位点也明显与中国少数民族食管癌高发区新疆哈萨克族和维吾尔族人群食管鳞癌高风险密切相关，同时还与贲门腺癌高风险相关。经基因库检索发现，C20orf54就是RFT2，从而揭示了老一代科学家发现的核黄素缺乏与食管癌发生关系的分子机制，也不同程度解释了核黄素补充干预存在明显个体差异现象的分子基础。作为食管癌高风险遗传标签，RFT2基因rs13042395位点发生的SNP变异已被应用到食管癌高危人群预警和筛查中，明显提高了早期癌的发现率。

2.3RFT2最新研究进展①癌组织RFT2全基因组测序发现10个突变位点，主要集中在第3外显子(5个)，其次是第5外显子(2个)和第2外显子(2个)，第1外显子发生1个突变位点。同时还发现高、低发区癌组织突变类型不同，这一结果提示RFT2不仅是一个重要的易感基因，同时还是一个重要的致病基因，不同的环境因素可能在RFT2突变中起重要作用[2]。②癌组织分析发现RFT2存在2种不同类型的蛋白表达，分别为469个和415个氨基酸，并据此将RFT2蛋白分类为RFT2a(469个氨基酸)和RFT2b(415个氨基酸)。很显然，进一步了解这2种不同的蛋白类型对食管癌发生发展的影响将有助于加深对RFT2功能的了解。③RFT2基因rs13042395 SNP位点CC基因型的食管癌患者生存期明显差于CT基因型，提示RFT2基因型也是一个重要的预后指标。④食管癌组织中RFT2明显高表达；敲除或降低食管癌细胞系RFT2蛋白表达能明显降低四羟酮醇或黄素(核黄素的激活状态)水平和线粒体膜电位及细胞ATP水平，抑制细胞增殖、克隆形成和浸润；敲除RFT2可明显降低P21和P27蛋白表达，进一步导致其下游CyclinE1和CDK2蛋白表达以及pRb低磷酸化，最终导致细胞停滞在G1～G1/S期；此外还发现，敲除RFT2能够降低抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl和Survivin的表达；与此相反，食管癌细胞系RFT2过表达显现出对化疗药物顺铂的抗性，可以抵抗顺铂诱导的细胞凋亡[34]。⑤喂饲食管癌高发区四川盐亭居民饮食(低核黄素)的大鼠血清处理人食管癌细胞系明显促进细胞增殖，并能明显诱导CyclinD1和CDK4蛋白及mRNA高表达，而P16和Rb呈现低表达，补充包括核黄素的复合维生素能够逆转这些改变[32]。⑥RFT2变异明显提高胃癌和脑胶质瘤发病风险[35-36]。

综上，RFT2基因既是一个重要的易感基因，同时也是一个重要的致病基因；RFT2通过维持核黄素内稳态及能量代谢等支持肿瘤细胞的快速恶性增殖并逃逸细胞凋亡，在食管癌发生发展过程中起重要作用；RFT2基因还与作者以前发现的食管癌变过程中P53-Rb通路频发改变的多个基因(cyclinE1、cdk2、bcl-2、bcl-xl、survivin、p21、p27、p16、Rb、cyclinD1、cdk4等)相关，提示环境-遗传-基因互作在食管癌发生中起重要作用。这些研究结果为食管癌高危人群分子分型的界定及个体化防治提供了重要的技术支撑。现将核黄素缺乏(环境因素)、RFT2基因多态(遗传因素)与食管癌变多阶段演进P53-Rb通路分子变化(环境-基因互作)关系总结于图2。

图2 RFT2-NOTCH1-P53-Rb 互作关系

3 展望

目前尚无规范化食管癌高危人群预警筛查早期发现和防治指南。建立高危人群客观评价标准是实施食管癌精准防治的关键。传统上，高发区、40岁以上、男性、吸烟饮酒、家族史阳性的无症状人群被笼统界定为“高危或高风险人群”，也是早期食管癌主要筛查对象。由于色素内镜和活检病理及内镜下治疗技术的快速推广应用，传统的食管拉网脱落细胞学早期发现筛查手段已完全被色素内镜所取代。但是，需要特别指出的是，内镜检查需要经验、复杂的设备和程序，并且微创和不适，特别是高成本和低效率，不容易被大众接受。例如，常规高发区内镜筛查上述“高危人群”，早期癌的发现率仅2%左右，癌前病变10%左右，约90%的无症状“高危人群”均为“陪伴检查”等，这些局限性限制了内镜在无症状高危人群食管癌预警筛查和早期发现中的推广应用。

因此，基于“环境-遗传-基因互作”食管癌变机制的新模式，建立界定高危人群的分子分型标准，确定用于预警筛查、早期发现、早期诊断和个体化防治的分子靶标，利用一滴血检测这些分子标签，确定高危人群，然后对这些高危人群进行色素内镜和活检病理检查，将极大提高早期癌和癌前病变患者的检出率，从而为最终降低食管癌发病率和死亡率提供重要技术支撑。本研究组利用这一思路，对食管癌高发区无症状1.1万例居民进行外周血易感基因位点、自身抗体等检测，确定660例高危人群，然后对这些高危人群进行色素内镜和黏膜活检，发现234例食管癌患者，较传统无症状人群内镜筛查早期癌2%的发现率提高了近18倍，作者据此提出食管癌高危人群预警筛查和早期发现的思路(图3)。越来越多的研究结果正在不断丰富“环境-遗传-基因互作”食管癌变机制的新模式，这些研究将为进一步建立食管癌高危人群预警筛查、早期发现和防治提供重要理论和技术支撑。

图3 食管癌高危人群预警筛查和早期发现思路图

致谢：非常感谢澹会芳、韩少华、樊冰雨、李孟祥在论文撰写过程中给予的帮助。

[1] WANG LD,ZHOU FY,LI XM,et al.Genome-wide association study of esophageal squamous cell carcinoma in Chinese subjects identifies susceptibility loci at PLCE1 and C20orf54[J].Nat Genet,2010,42(9):759

[2] AGRAWAL N,JIAO Y,BETTEGOWDA C,et al.Comparative genomic analysis of esophageal adenocarcinoma and squamous cell carcinoma[J].Cancer Discov,2012,2(10):899

[3] 黄静,刘利敏,杨建学,等.贲门癌和其癌旁组织核黄素转运基因全基因外显子测序[J].郑州大学学报(医学版),2012,47(5):727

[4] 王立东,宋昕,赵学科,等.食管癌环境和遗传危险因素交互作用的分子基础和精准预防[J].中国肿瘤临床,2016,43(12):515

[5] YANG CS,SUN Y,YANG QU,et al.Vitamin A and other deficiencies in Linxian,a high esophageal cancer incidence area in northern China[J].J Natl Cancer Inst,1984,73(6):1449

[7] FOY H,KONDI A.The vulnerable esophagus:riboflavin deficiency and squamous cell dysplasia of the skin and the esophagus[J].J Natl Cancer Inst,1984,72(4):941

[8] THURNHAM DI,RATHAKETTE P,HAMBIDGE KM,et al.Riboflavin,vitamin A and zinc status in Chinese subjects in a high-risk area for oesophageal cancer in China[J].Hum Nutr Clin Nutr,1982,36(5):337

[9] DAWSEY SM,WANG GQ,TAYLOR PR,et al.Effects of vitamin/mineral supplementation on the prevalence of histological dysplasia and early cancer of the esophagus and stomach:results from the dysplasia trial in Linxian,China[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,1994,3(2):167

[10]WAHRENDORF J,MUOZ N,LU JB,et al.Blood,retinol and zinc riboflavin status in relation to precancerous lesions of the esophagus:findings from a vitamin intervention trial in the People′s Republic of China[J].Cancer Res,1988,48(8):2280

[11]YANG CS,SUN Y,YANG QU,et al.Vitamin A and other deficiencies in Linxian, a high esophageal cancer incidence area in northern China[J].J Natl Cancer Inst,1984,73(6):1449

[12]吕全军,王华丽,胡同宇,等.林州市食管癌高发区人群维生素营养状况的动态变化研究[J].卫生研究,2007,36(6):719

[13]王立东,郭花芹,裘宋良,等.食管癌高发区青少年维生素营养状况[J].河南医科大学学报,1992,27(2):126

[14]YONEZAWA A,INUI KI.Novel riboflavin transporter family RFVT/SLC52:identification, nomenclature, functional characterization and genetic diseases of RFVT/SLC52[J].Mol Aspects Med,2013,34(2/3):693

[15]ZARIDZE DG,BUKIN IUV,DRAUDIN-KRYLENKO VA,et al.Riboflavin supply of the Kara-Kalpak ASSr population with pathologic changes of the esophageal mucosa[J].Vopr Pitan,1989(2):21

[16]ZARIDZE DG,BUKIN IUV,ORLOV EN,et al.Relationship between the character of pathological changes in the esophageal mucosa and deficiency of several vitamins in a population with high incidence of esophageal cancer[J].Vopr Onkol,1989,35(8):939

[17]QIAO YL,DAWSEY SM,KAMANGAR F,et al.Total and cancer mortality after supplementation with vitamins and minerals:follow-up of the Linxian General Population Nutrition Intervention Trial[J].J Natl Cancer Inst,2009,101(7):507

[18]JIANG Y,DU HZ,ZHU WY,et al.Effects of a regional Chinese diet and its vitamin supplementation on proliferation of human esophageal cancer cell lines[J].Biomed Environ Sci,2008,21(5):442

[19]江岩,朱文艺,黄承钰,等.盐亭饮食及维生素对人食管癌细胞株生长增殖的影响[J].四川大学学报(医学版),2007,38(4):624

[20]WANG GQ,DAWSEY SM,LI JY,et al.Effects of vitamin/mineral supplementation on the prevalence of histological dysplasia and early cancer of the esophagus and stomach:results from the General Population Trial in Linxian,China[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,1994,3(2):161

[21]HE Y,YE L,SHAN B,et al.Effect of riboflavin-fortified salt nutrition intervention on esophageal squamous cell carcinoma in a high incidence area, China[J].Asian Pac J Cancer Prev,2009,10(4):619

[22]HOU J,LIN PZ,CHEN ZF,et al.Field population-based blocking treatment of esophageal epithelia dysplasia[J].World J Gastroenterol,2002,8(3):418

[23]李烨.食管癌高发区核黄素强化碘盐干预效果研究及核黄素对食管癌细胞Eca109的生长影响[D].石家庄:河北医科大学,2009.

[24]贺宇彤,李烨,单保恩,等.食管癌高发区核黄素强化盐干预效果评价[J].中国公共卫生,2009,25(3):304

[25]沈琼,王东煜,项芸岩,等.食管癌前增生营养阻断研究初步报告[J].中国肿瘤临床,1991,18(1):34

[26]李纪宾,邹小农,王华余,等.盐亭县核黄素强化盐干预试验人群食管癌前病变与转归的研究[J].中华肿瘤防治杂志,2009,16(5):325

[27]SIASSI F,GHADIRIAN P.Riboflavin deficiency and esophageal cancer: a case control-household study in the Caspian Littoral of Iran[J].Cancer Detect Prev,2005,29(5):464

[28]IBIEBELE TI,HUGHES MC,PANDEYA N,et al.High intake of folate from food sources is associated with reduced risk of esophageal cancer in an Australian population[J].J Nutr,2011,141(2):274

[29]居来提·艾尼瓦尔.核黄素及其转运基因变异与新疆哈萨克族食管鳞状细胞癌发病相关性研究[D].乌鲁木齐:新疆医科大学,2014.

[30]纪爱芳,魏武,王金胜,等.食管鳞癌患者血浆及组织核黄素水平的比较及其意义[J].肿瘤防治研究,2012,39(4):467

[31]LI SS,XU YW,WU JY,et al.Plasma riboflavin level is associated with risk, relapse, and survival of esophageal squamous cell carcinoma[J].Nutr Cancer,2017,69(1):21

[32]江岩.添加几种维生素饮食对人食管癌细胞增殖影响及其机制研究[D].成都:四川大学,2007.

[33]JIANG XR,YU XY,FAN JH,et al.RFT2 is overexpressed in esophageal squamous cell carcinoma and promotes tumorigenesis by sustaining cell proliferation and protecting against cell death[J].Cancer Lett,2014,353(1):78

[34]蒋兴然.核黄素转运基因2(RFT2)在食管癌中的表达及作用研究[D].北京：北京协和医学院,2014.

[35]FU T,LIU Y,WANG Q,et al.Overexpression of riboflavin transporter 2 contributes toward progression and invasion of glioma[J].Neuroreport,2016,27(15):1167

[36]MATNURI M,ZHENG C,SIDIK D,et al.Correlation analysis of riboflavin,RFT2 and Helicobater pylori in gastric carcinoma[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(10):13339