蜂胶乙醇提取物对断奶仔猪肠道菌群及肠道黏膜免疫功能的影响

王 留，方磊涵，王向国

（商丘职业技术学院，河南 商丘 476000）

断奶仔猪由于肠道结构和生理功能发育不完善，肠道微生物区系生态平衡尚未完全建立和肠道黏膜免疫功能尚不健全，致使断奶仔猪的饲养管理成为养猪生产中最难管理的阶段，也是决定养猪生产经济效益的关键阶段。在断奶仔猪饲料或饮水中添加天然提取物，促进仔猪肠道菌群的建立与肠道微生物区系的生态平衡，以及促进肠道黏膜免疫功能的提高成为养好断奶仔猪的有效措施之一。蜂胶是蜜蜂在采集花粉、酿制蜂蜜过程中形成的一种天然产物，具有抗菌、免疫调节、抗氧化应激等多种生物学活性[1-3]。为了研究蜂胶乙醇提取物对断奶仔猪肠道菌群及肠道黏膜免疫功能的影响，本试验在饮水中添加不同浓度的蜂胶乙醇提取物，测定断奶仔猪粪便中乳酸菌、大肠杆菌、双歧杆菌、沙门氏菌等有益菌与有害菌的数量和肠道分泌性免疫球蛋白A（sIgA）含量的变化，探索蜂胶乙醇提取物调节断奶仔猪肠道菌群生态平衡和改善肠道黏膜免疫功能的机制，为蜂胶产品的开发和在动物生产中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

电子天平，电热恒热水浴锅，恒温培养箱，台式冷冻离心机，酶标反应板，酶标仪。sIgA双抗体夹心ELISA（酶联免疫吸附试验）检测试剂盒购于上海生工生物工程公司。乳酸菌培养基（MRS）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）培养基、麦康凯培养基（MAC）、沙门菌属琼脂培养基（SS）购于青岛海博生物技术有限公司。

1.2 试验材料

蜂胶乙醇提取物，商丘职业技术学院药理实验室自制，详见参考文献[3]。

1.3 试验动物

30头28日龄杜长大三元杂交断奶仔猪随机平均分成3组，各组均饲喂玉米-豆粕型基础饲粮。试验期间，试验1和2组断奶仔猪饮水中分别添加终浓度为1和2 g/L的蜂胶乙醇提取物，自由饮水；空白对照组正常饮水。试验于2017年6月3—30日在商丘牧原科技有限公司养猪场进行，断奶仔猪均采用高床饲养，保健与免疫按该场年度保健计划与免疫程序进行。试验期28 d。

1.4 样品采集

分别于仔猪42和56日龄时每组采集20 g新鲜粪样，分成两份，分装于封口袋中，并做好标记。-80℃冰箱保存备用。一份用于检测粪样sIgA，另一份用于检测肠道菌群。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 肠道菌群培养计数 在无菌操作台中，准确称取1 g均匀混合的粪样，加入到装有9 mL无菌生理盐水的试管中，充分振荡混合均匀后作递增的10倍倍比稀释至10-7g/mL，吸取相应稀释度的粪便稀释液0.1 mL滴加于选择性培养基上，每个稀释度3个重复。乳酸菌、双歧杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌分别以MRS培养基、MRS+X-gal培养基、MAC培养基、SS培养基于37℃培养48 h后进行菌落计数，计算每克粪样中的活菌数（CFU·g-1）。

1.5.2 粪样中sIgA的测定 在无菌操作台中，准确称取1 g均匀混合的粪样，加入到装有9 mL无菌生理盐水的试管中，充分振荡混合均匀后3 000 r/min离心10 min，取上清液备用。采用猪sIgA双抗体夹心ELISA检测试剂盒测定粪便上清液中sIgA，检测方法严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.6 试验数据处理

试验数据用平均值±标准差表示，采用SPSS 19.0统计处理软件进行方差分析，P＜0.05判定为差异显著。

2 结果

2.1 蜂胶乙醇提取物对断奶仔猪肠道菌群的影响

试验结果表明（表1），1和2 g/L蜂胶乙醇提取物组断奶仔猪在42日龄和56日龄时肠道内的大肠杆菌、沙门氏菌数量均低于空白对照组，且2 g/L蜂胶乙醇提取物组断奶仔猪在56日龄时肠道的大肠杆菌、沙门氏菌数量与空白对照组相比差异显著（P＜0.05）。1和2 g/L蜂胶乙醇提取物组断奶仔猪在42日龄和56日龄时肠道内的乳酸菌、双歧杆菌数量与空白对照组相比差异不显著（P＞0.05）。

2.2 蜂胶乙醇提取物对断奶仔猪肠道分泌型sIgA的影响

由表1可知，蜂胶乙醇提取物能够提高断奶仔猪肠道分泌型sIgA水平。饮水中添加1 g/L的蜂胶乙醇提取物的试验组断奶仔猪，在42和56日龄时，肠道分泌型sIgA水平与空白对照组相比有一定程度提高，但是差异不显著（P＞0.05）。饮水中添加2 g/L的蜂胶乙醇提取物的试验组断奶仔猪，在56日龄时，肠道分泌型sIgA水平与空白对照组相比有较大提高，差异显著（P＜0.05）。

表1 蜂胶乙醇提取物对断奶仔猪肠道菌群、肠道分泌型sIgA的影响

3 讨论与分析

3.1 蜂胶乙醇提取物对断奶仔猪肠道菌群的影响

肠道菌群是一个复杂的微生物生态系统，肠道菌群与动物的营养吸收、免疫功能、生长发育、健康状况等密切相关，肠道菌群的失衡会导致动物的生理代谢和生理机能发生障碍，引发动物腹泻、免疫功能降低、抗病力差等相关疾病。动物肠道微生物种类众多，大肠杆菌、沙门氏菌等细菌是断奶仔猪肠道菌群中的主要有害菌，而乳酸菌、双歧杆菌是主要的有益菌。在动物饲料或饮水中添加天然提取物，提高动物肠道中乳酸菌、双歧杆菌等有益菌的数量，抑制或降低大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌的数量，改善动物肠道微生物区系，建立肠道菌群的动态平衡，有助于提高动物的生长性能和抗病能力[4-5]。

本试验在断奶仔猪饮水中添加不同剂量的蜂胶乙醇提取物，通过测定粪便中菌群的变化以反映蜂胶乙醇提取物对断奶仔猪肠道微生物区系的影响。试验结果显示，蜂胶乙醇提取物能够抑制试验组断奶仔猪肠道中大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌的生长，减少粪便中大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌的数量，随蜂胶乙醇提取物添加浓度和添加时间的增加，对仔猪肠道中大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌的抑制作用逐渐显著，56日龄时饮水中添加2 g/L的蜂胶乙醇提取物的试验组断奶仔猪粪便中大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌的数量显著低于空白对照组。蜂胶乙醇提取物对试验组断奶仔猪肠道中乳酸菌、双歧杆菌有促进作用，但与空白对照组相比差异不显著。说明蜂胶乙醇提取物能够降低断奶仔猪肠道内有害菌的数量和重建仔猪肠道菌群平衡。

3.2 蜂胶乙醇提取物对断奶仔猪肠道分泌型sIgA的影响

肠道既是营养物质消化吸收的重要场所，也是动物体内最大的免疫器官，通过肠道黏膜的机械屏障、生物屏障和免疫屏障作用阻断或清除病原微生物的感染。分泌型sIgA是肠道黏膜免疫的主要免疫效应因子，sIgA通过与病原微生物的抗原相结合清除或杀灭肠腔、肠上皮细胞、黏膜固有层内的病原体。左伟勇等[6]在仔猪饲粮中添加2%的低分子量大豆肽能显著降低仔猪空肠肠道大肠杆菌数，显著提高乳酸杆菌数和空肠黏膜sIgA水平。Lessard等[7]给仔猪饲喂益生菌后，肠黏膜表面slgA的分泌量显著增加，提高了仔猪肠道黏膜免疫力。张丹等[8]给BALB/c小鼠灌胃嗜酸乳杆菌14 d后，肠黏膜sIgA含量明显升高，嗜酸乳杆菌定植于肠黏膜并形成生物屏障保护，并提高其免疫功能。在本试验中，42日龄和56日龄时，饮水中添加1和2 g/L蜂胶乙醇提取物组断奶仔猪肠道分泌型sIgA水平均高于空白对照组，且2 g/L蜂胶乙醇提取物组断奶仔猪在56日龄时肠道分泌型sIgA水平显著高于空白对照组。说明饮水中添加2 g/L蜂胶乙醇提取物能够显著提高断奶仔猪肠道分泌型sIgA的合成与分泌，改善仔猪肠道黏膜免疫功能。

[1]王秉彼，张慧娟.北京蜂胶的化学成分研究 [J].中药通报，1988，13（10）：37-38.

[2]迟家平，薛秉文，陈海生.辽西蜂胶黄酮类化学成分的研究[J].中国药学杂志，1996，31（5）：264-266.

[3]王留，方磊涵，王向国.蜂胶乙醇提取物对断奶仔猪生长性能和抗氧化功能的影响[J].养猪，2017（4）：15-16.

[4]杨田田，于龙魅，刘二强，等.天蚕素A-马盖宁杂合肽对小鼠小肠黏膜结构小肠黏膜免疫功能和肠道菌群的影响[J].动物营养学报，2014，26（11）：3387-3395.

[5]王留，王向国.大枣多糖对保育猪肠道微生物菌群及肠道组织形态的影响[J].养猪，2014（6）：7-8.

[6]左伟勇，洪伟鸣，陈高，等.低分子质量大豆肽对断奶仔猪肠道免疫功能的影响[J].南京农业大学学报，2013，36（5）：108-112.

[7]Lessard M,Dupuis M,Gagnon N,et a1．Administration of Pediococcus acidilactici or Saccharomyces cerevisiae boulardii modulates development of porcine mucosal immunity and reduces intestinal bacterial translocation after Escherichia coli challenge[J]．J Anim Sci,2009,87(3):922-934．

[8]张丹，张丹丹，章金叶，等.嗜酸乳杆菌S-层蛋白对感染大肠杆菌小鼠肠黏膜免疫功能的影响 [J].现代食品科技，2015，31（10）：13-17.