毛细管区带电泳测定大黄提取物中有效成分的含量*

曾 雪，杨元娟，陈 竹，刘应杰，夏培元

(1.重庆医药高等专科学校 401331；2.第三军医大学西南医院药剂科，重庆 400050；3.重庆市药物制剂工程技术研究中心 401331；4.重庆市食品药品检验检测研究院 401121；5.重庆市化学药品质量控制与评价协同创新中心 401121)

药用大黄是我国常用中药，具有多种药理作用[1-3]。有效成分的检测方法主要有纸色谱法、柱色谱法(HPLC)[4]、薄层色谱法[5]和高效液相色谱法[6-8]，但液相色谱操作过程复杂，流动相处理要求高，试剂消耗量大。高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis,HPCE)是一种具有灵敏度和分辨率高、成本较低的分离分析技术[9-10]。本研究以大黄为对象，回流提取有效成分，并采用高效毛细管电泳作为分离和检测手段，通过加入β-环糊精和调节缓冲溶液pH实现更好分离效率，该方法国内尚无相关研究，是液相色谱法的一个有力补充[11-13]。

1 材料与方法

1.1材料 CL1020高效毛细管电泳仪(紫外检测器，北京彩陆仪器有限公司，中科院研究生院应化所，中国)，GWA-UN1型超纯水器(北京普析通用仪器有限公司，中国)，SK-1涡旋混合器(常州市国旺仪器制造有限公司，中国)，AUX220电子天平(岛津,日本)。Na2B4O7·10 H2O(分析纯，重庆北碚精细化工工厂)；无水碳酸钠(分析纯，重庆北碚精细化工工厂)；羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD，相对分子量1 459.8，ACROS ORGANICS,New Jersey,USA)；大黄素(C15H10O5，批号must-14110704)、大黄酚(C15H10O4，批号must-14072415)和大黄酸(C15H8O6，批号must-14072401，HPLC纯度大于或等于98.0%)对照品(美仑生物科技有限公司，中国)，药用大黄饮片(四川省阿坝州松潘县药用大黄栽培基地)，其他试剂均采用分析纯。

1.2方法

1.2.1对照品溶液的制备 精密称取大黄素对照品、大黄酸对照品和大黄酚对照品适量，加甲醇分别制成每1 mL含大黄酸、大黄素、大黄酚各8.0 mg的对照品贮备液；分别精密量取上述对照品贮备液各2 mL，定容至10 mL,混合摇匀，即得(每1 mL中大黄素、大黄酸、大黄酚各1.6 mg)。

1.2.2供试品溶液的制备 取药用大黄饮片粉碎，取粉末(过四号筛)约0.15 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5 mL，置烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液10 mL，超声处理5 min，再加三氯甲烷10 mL，加热回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得[14-15]。

1.2.3电泳条件

1.2.3.1毛细管预处理 采用67.4 cm×75.0 μm石英毛细管柱(有效长度51.0 cm，河北永年瑞丰色谱配件有限公司)为分离柱，毛细管分别用0.1 mol/L NaOH冲洗活化10 min，水洗5 min，再用缓冲溶液冲洗5 min。每次进样前都分别用0.1 mol/L NaOH冲洗3 min，水洗1 min，再用缓冲溶液冲洗2 min，以保证迁移时间和峰面积的重现性。

1.2.3.2电泳条件设定 分离电压范围：15～30 kV，进样方式采用压差进样，进样时间5 s，操作温度25 ℃，缓冲溶液：60 mmol/L Na2B4O7+40 mmol/L Na2CO3+40 mmol/L HP-β-CD(pH 8.9)；供试品缓冲溶液与此相同。

2 结 果

2.1电泳条件优化

2.1.1检测波长的选择 大黄素和大黄酸的吸收波长均在250～270 nm处，其中254 nm为最大吸收波长。大黄酚在254、530 nm处有最大吸收，依据中国药典2015版，均采用254 nm为检测波长，因此本实验采用254 nm波长为检测波长。

2.1.2进样方式的选择 毛细管电泳的进样方式对分离效率和重现性有重要影响，压力进样和电动进样为最常见的两种进样方式，电动进样对粘度较大的生化样品比较适合，但测量重现性较差，且可能因各组分扩散系数的差别而导致迁移速率的改变，本试验的标本为大黄提取物，相对生化样品粘度较低，且注重重现性，因此选择压力进样作为进样方式。采用进样压力0.5 psi，进样实践0.5 s。

2.1.3缓冲溶液及浓度的优化 由于大黄素、大黄酚和大黄酸的结构近似，电荷差异小，且大黄提取中成分较多，采用区带电泳分离模式(CZE)较难实现3种目标组分的完全分离，因此本试验通过在缓冲体系中加入低浓度HP-β-CD，在传统的CZE电泳模式下引入胶束电色谱模式，利用3组分在分配系数上的差异，当HP-β-CD浓度达到40 mmol/L时，实现完全分离，见图1、2。

A:大黄素；B:大黄酚；C:大黄酸

图1大黄主要活性成分结构式

2.2方法学验证

2.2.1精密度试验 精密量取“1.2.1”项下对照品溶液，按“1.2.3.1”项下电泳条件连续进样测定3次，记录峰面积。大黄素、大黄酚和大黄酸相对标准偏差(RSD)分别是 1.79%、4.46%和2.30%，表明仪器精密度良好，见表1。

2.2.2线性范围 分别精密吸取“1.2.1”项下大黄素、大黄酚和大黄酸对照品溶液2 mL于10 mL容量瓶中定容，配置成浓度为1.6 mg/mL对照品溶液，再分别吸取对照溶液0.3、0.8、1.3、1.8、2.3、2.8 mL，置于6个10 mL容量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，摇匀，得等浓度梯度对照品溶液，并分别以“1.2.3”项下电泳条件进行电泳分析检测，分别以3组分对照品浓度为横坐标(X)，以对照品峰面积为纵坐标(Y)进行回归计算，得到大黄素回归方程为：Y=0.079 4X-0.034 6，r=0.995 7；大黄酚回归方程为：Y=0.085 3X-0.042 8,r=0.995 9；大黄酸回归方程为：Y=0.078 4X-0.073 2,r=0.995 4，鉴于压力进样存在一定误差，3组分共同线性范围在1.1～19.0 mg/mL范围内线性关系良好。

2.2.3回收率试验 精密称取大黄样品粉末约1.5 g，共3份，分别置于5个锥形瓶中，按“1.2.2”项下“大黄提取物供试品”方法制备供试品溶液，先按“1.2.3”项下电泳条件检测并记录每份样品的电泳谱图，再在每份供试品中加入等量的大黄素、大黄酚和大黄酸对照品各3 mg，再次测定其含量，分别计算大黄素、大黄酚和大黄酸的平均回收率，结果显示该方法单组分回收率较好，多组分RSD偏高，分析可能是由于大黄提取物成分较多，且本方法是同时考察3组分在电泳中含量，目标组分间存在化学性质差异，导致检测效率不一致所致，见表2。

A:CZE 模式下CE分离检测；B:HP-β-CD修饰后CZE模式下大黄混合标品CE分离检测；C:HP-β-CD修饰后CZE模式下大黄提取物CE分离检测

图2 HP-β-CD修饰前后大黄毛细管电泳对比图

表2 回收率试验结果(n=3)

2.3样品含量测定 对3批样品进行含量测定，分别精密称取不同批次大黄药材样品粉末约1.5 g，按“1.2.2”项下“大黄提取物供试品”方法制备供试品溶液，再按“1.2.3”项下电泳条件进行电泳分离检测，分别记录大黄素、大黄酚和大黄酸含量，见表3。

表3 3批次样品中大黄提取物的含量测定结果(n=3,%)

3 讨 论

大黄素、大黄酚、大黄酸3组分化学结构相似，带电差异小，CZE模式分离效果较差，本文加入HP-β-CD是因为环糊精分子略呈锥形的中空圆筒立体环状结构，具有一定的疏水性，增加了普通缓冲溶液的多相特性，待测组分在环糊精修饰的缓冲体系中，由于不同的疏水性而呈现出不同的分配系数，从而使不同组分在毛细管电泳中不仅受到电渗流的影响，同时也受到分配色谱的影响，有利于组分的完全分离。

电泳进样方式对本方法的重现性和稳定性有很大影响，电动进样操作简便且进样量稳定，但更适合于粘度较大的生化样品，而本文是中药提取物且带电性不明显，用电动进样不利于样品的导入，所以采用压力进样，保证了进样的重现性。

方法学考察中含量测定的RSD偏高，分析原因是因为本方法优先考虑大黄提取物多组分的分离度，在保证完全分离基础上，牺牲了部分检测准确度,导致结果RSD偏高，可在后期方法优化上进一步改进。

通过β-环糊精修饰毛细管区带电泳测定大黄提取物的方法分析速度快，缓冲溶液简单，试剂消耗量少，可作为高效液相法的重要补充。

[1]刘晗，高云．大黄素药理作用的分子机制研究进展[J]．中国药理学通报，2009，25(12)：1552-1555．

[2]SUNEELA D,DIPMALA P.Synthesis and pharmacokinetic profile of rhein- boswellic acid conjugate[J].Bioorg Med Chem Lett,2012,22(24):7582-7587.

[3]纪春梅，甄永占，骆广玲，等．赖氨大黄酸通过升高miRNA-451抑制肺癌A549细胞迁移[J]．第三军医大学学报，2014，36(3)：248-252．

[4]赵东梅，王威，刘坤，等．柱色谱-高速逆流色谱法分离纯化虎杖中大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[J]．中草药，2016，47(12)：2118-2122．

[5]王晓剑，张悠，王晓红．大黄散质量标准研究[J]．山西医科大学学报，2016，47(11)：988-991．

[6]马惠玲，谢鑫，麦曦，等．高效液相色谱法测定黄连上清丸中芦荟大黄素和大黄酸的含量[J]．南昌大学学报(医学版)，2016，56(3)：16-19．

[7]潘丽丽，李亭亭，杨颂，等．HPLC法同时测定牛黄解毒片中黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、大黄素的含量[J]．中医药学报，2015，43(1)：50-53．

[8]李莉，宋俊骊，王志梅，等．高效液相色谱法同时测定九制大黄丸中5组分含量[J]．中国药业，2015，24(5)：34-36．

[9]刘会前．HPLC法测定保肾灵I号中大黄素和大黄酚的含量[J]．重庆医学，2005，34(11)：1703-1704．

[10]郭芳芳，冯锋，白云峰，等．高效毛细管电泳用于检测黄花菜中4种活性物质[J]．食品科学，2016，37(4)：73-76．

[11]陈琴华，李鹏，朱军．毛细管电泳技术在黄酮类化合物分析中的应用进展[J]．医药导报，2012，31(10)：1329-1333．

[12]于虹敏,林文津,徐榕青,等.毛细管电泳技术在药学研究的应用概述[J].中国民族民间医药,2012,21(1):34.

[13]王德先，赵敬湘，杨更亮，等．毛细管区带电泳法测定中药金银花中绿原酸的含量[J]．中草药，2000，31(6)：432-434．

[14]杨世颖，刘淑聪，杜冠华，等．大黄中药材及其醇、水提取物中大黄素成分分析标准物质研究[J]．中国中药杂志，2016，41(3)：456-462．

[15]林海丹，翟海云，周清．毛细管电泳法同时测定牛黄解毒片中大黄酸和大黄素的含量[J]．中药材，2012，35(6)：992-993．