银杏蜜环口服溶液减轻脑缺血再灌注大鼠脑梗死的实验研究

宋文婷 刘建勋 姚明江 王光蕊 王益民 王 勇 徐 立

(1 中国中医科学院西苑医院基础医学研究所，中药药理北京市重点实验室，北京，100091； 2 西安步长中医心脑病医院，西安，710082)

银杏蜜环口服溶液由银杏叶提取物、天麻蜜环菌粉组成。其主要组分银杏叶提取物可改善脑部及周边血液循环，天麻蜜环菌可镇静安神。银杏蜜环口服溶液上市后，广泛用于缺血性脑血管疾病、慢性脑低灌注、老年性高血压等脑部疾病，可改善血压、血流和脑缺血症状[1-5]；也广泛应用于心绞痛的临床治疗[6-7]，可改善心肌缺血的症状。

本课题组前期实验研究证明银杏蜜环口服溶液可保护缺氧复氧的血管内皮细胞，其保护作用可能是通过作用p38 MAPK调节eNOS/NO信号途径实现的[8]。然而银杏蜜环口服溶液对于实验动物脑梗死的保护作用尚未见报道。故本研究采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，研究银杏蜜环口服溶液的脑保护及抗氧化作用，并比较其全方和主要组分的药效，探讨组分间的协同作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SD种大鼠，雄性，220～240 g，由维通利华(北京)实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2012-0001。合格证号：11400700161146。

1.1.2 药物 1)银杏蜜环口服溶液(邛崃天银制药有限公司生产，批号：160312)；2)银杏叶提取物(邛崃天银制药有限公司生产，批号：160402)；3)天麻蜜环菌粉(邛崃天银制药有限公司生产，批号：20151027)；4)金纳多(银杏叶提取物片，德国威玛舒培博士药厂生产，批号：5260613)；5)天麻蜜环菌片(江苏神华药业有限公司生产，批号：20160602)

1.1.3 试剂与仪器 氯化-2,3,5-三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride，TTC)，国药集团化学试剂有限公司，用0.2 mol/L PBS(pH 7.2)配成1.2%浓度，低温避光保存；水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司，批号20131027)；SOD、GSH-PX、MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所提供，批号分别为：20161216，20161216，20161217)，尼龙栓线(北京西浓科技有限公司2432-100型)。多媒体彩色病理图文分析系统，国产MPIAS-500型。超声破碎仪，美国SONICS VCX150PB型。超速离心机，日本HITACHI 55P-72型。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 动物随机分配入各组中：假手术组，模型组，金纳多18 mg/kg组，银杏叶提取物(银提)9 mg/kg组，天麻蜜环菌素片(蜜环菌片)600 mg/kg组，天麻蜜环菌粉(蜜环菌粉)300 mg/kg组，银杏蜜环口服溶液618 mg/kg(银蜜高剂量)组，银杏蜜环口服溶液309 mg/kg(银蜜低剂量)组，共8组，每组10只。用4%水合氯醛麻醉大鼠(1 mL/100 g)，以恒温电热毯将动物体温维持在37 ℃，动物仰卧位固定，沿颈部中线切开皮肤及皮下组织，分离右侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA)，结扎ECA与CCA，夹闭ICA远心端，于ECA与ICA分叉处作一“V”字形切口，插入直径为0.24 mm的尼龙线栓，松开动脉夹，继续插入尼龙线至稍有阻力后略回撤，线栓插入深度为(20±2)mm左右，尼龙线外留约1 cm，缝合颈部切口，插线的末端固定于切口外。1.5 h后轻轻提拉线头至略有阻力，表明线的头端已抽出颈内动脉，实现再灌注，剪断插线皮外段。模型成功的标志：动物麻醉清醒后出现缺血侧Horner′s征及对侧以前肢为主的偏瘫，无此症状的弃去不用，其余回笼饲养，并保持体温。

1.2.2 给药方法 在插入线栓(缺血)后经十二指肠给予各受试药物。除银杏蜜环口服溶液618 mg/kg组外，各给药组均按3 mL/kg体积给予受试药物，假手术和模型组按3 mL/kg体积给予生理盐水。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 神经行为学评分 采用单盲法观察大鼠神经行为学，以Longa 5分制评分标准[9]：无神经损伤症状，0分；不能完全伸展左侧前爪，1分；向非缺血侧转圈，2分；行走时向非缺血侧倾倒，3分；不能自发行走，意识昏迷，4分。于缺血后6 h、24 h各进行1次评分。

1.2.3.2 脑梗死范围 动物进行末次神经行为评分后，称体质量，以4%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，离心分离血清-80 ℃冻存；随后迅速断头取脑，置于冰浴台上，从前往后作冠状位切片，平均切成5个脑片(第四脑片先切0.5 mm薄片液氮冻存)，将大脑切片浸泡于1.2%TTC磷酸缓冲液中，37 ℃恒温避光孵育约10 min，正常脑组织染为玫瑰红色，脑梗死区不染色(白色)，将脑片浸泡于10%福尔马林溶液中固定4 h。福尔马林固定的脑片按脑的前后顺序整齐排列，经摄像头采样(固定采样高度)，用多媒体彩色病理图文分析系统计算大鼠全脑面积及脑梗死面积，以梗死面积/全脑面积表示脑梗死范围。

1.2.3.3 血清SOD、GSH-PX活力以及MDA水平检测 按照说明书进行检测。

2 结果

2.1 对脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑梗死范围、神经行为学的影响 缺血再灌注24 h，模型组大鼠术侧局部缺血严重，形成明显的梗死灶。与模型组比较，金纳多组、银杏叶提取物组及银杏蜜环口服溶液309 mg/kg和618 mg/kg剂量组脑梗死范围均显著减少，差异有统计学意义(P<0.01)。缺血后6 h，模型组动物可见明显的神经功能损伤，主要表现为左肩内收、屈曲，前肢无力，向非缺血侧转圈，行走时向非缺血侧倾倒等。与模型组比较，所有给药组均未表现出明显的改善神经症状的作用。缺血后24 h，与模型组比较，金纳多组、银杏叶提取物组、天麻蜜环菌片组及银杏蜜环口服溶液309 mg/kg和618 mg/kg剂量组均有明显改善神经症状的作用，差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表1，图1～2。

图1 银杏蜜环口服溶液对MCAO大鼠脑梗死范围的影响

注：与假手术组(正常对照组)比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与金纳多组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与银杏叶提取物比较，□P<0.05，□□P<0.01；与天麻蜜环菌片比较，■P<0.05，■■P<0.01；与天麻蜜环菌粉比较，#P<0.05，##P<0.01

图2 银杏蜜环口服溶液对MCAO大鼠行为学的影响

注：与假手术组(正常对照组)比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与金纳多组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与银杏叶提取物比较，□P<0.05，□□P<0.01；与天麻蜜环菌片比较，■P<0.05，■■P<0.01；与天麻蜜环菌粉比较，#P<0.05，##P<0.01

图3 银杏蜜环口服溶液对MCAO大鼠SOD活力的影响

注：与假手术组(正常对照组)比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与金纳多组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与银杏叶提取物比较，□P<0.05，□□P<0.01；与天麻蜜环菌片比较，■P<0.05，■■P<0.01；与天麻蜜环菌粉比较，#P<0.05，##P<0.01

图4 银杏蜜环口服溶液对MCAO大鼠 MDA水平的影响

注：与假手术组(正常对照组)比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与金纳多组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与银杏叶提取物比较，□P<0.05，□□P<0.01；与天麻蜜环菌片比较，■P<0.05，■■P<0.01；与天麻蜜环菌粉比较，#P<0.05，##P<0.01

图5 银杏蜜环口服溶液对MCAO大鼠血清GSH-PX的影响

注：与假手术组(正常对照组)比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与金纳多组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与银杏叶提取物比较，□P<0.05，□□P<0.01；与天麻蜜环菌片比较，■P<0.05，■■P<0.01；与天麻蜜环菌粉比较，#P<0.05，##P<0.01

表1 对MCAO大鼠脑梗死范围及神经行为学影响

注：与假手术组(正常对照组)比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与金纳多组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与银杏叶提取物比较，□P<0.05，□□P<0.01；与天麻蜜环菌片比较，■P<0.05，■■P<0.01；与天麻蜜环菌粉比较，#P<0.05，##P<0.01

表2 对MCAO大鼠血清SOD、MDA、GSH-PX的影响

注：与假手术组(正常对照组)比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与金纳多组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与银杏叶提取物比较，□P<0.05，□□P<0.01；与天麻蜜环菌片比较，■P<0.05，■■P<0.01；与天麻蜜环菌粉比较，#P<0.05，##P<0.01

2.2 对血清SOD、MDA、GSH-PX的影响 缺血再灌注后，模型组SOD及GSH-Px活力下降，MDA水平升高，与假手术组比较，差异有统计学意义(P<0.05～0.01)；给药后对照药金纳多18 mg/kg组大鼠血清SOD和GSH-Px活力增加，MDA水平下降，与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05～0.01)；银杏叶提取物9 mg/kg组及天麻蜜环菌片600 mg/kg组，作用较弱，上述指标均有改善趋势，但仅见GSH-Px活力显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)，天麻蜜环菌粉300 mg/kg组GSH-PX活力显著增加，与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05～0.01)；银杏蜜环口服溶液可以增加SOD和GSH-Px活力，降低MDA水平，与模型组比较，差异均有统计学意义(P<0.05～0.01)。见表2，图3～5。

3 讨论

脑梗死发生后，脑血流量中断，引起脑组织缺氧，缺氧及氧化应激是脑梗死病理级联反应中的重要环节。在缺血性神经元损伤过程中，氧化自由基可引发脂质过氧化瀑布效应，蛋白质变性失活，膜屏障功能受到严重影响，从而导致细胞死亡。氧自由基及其引起的脂质过氧化是缺血再灌注损伤的重要机制之一[10-11]。脑缺血时，由于三磷腺苷(ATP)生成减少，细胞色素氧化期间产生大量自由基，包括O2-，HO2-，OH-，H2O2等。自由基可广泛攻击富含不饱和脂肪酸的神经膜与血管，引发脂质过氧化瀑布效应，蛋白质变性失活，膜屏障功能受到严重影响，从而导致细胞死亡。氧自由基及其引起的脂质过氧化是缺血再灌注损伤的重要机制之一。MDA作为氧自由基与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的代谢产物，可间接反映体内脂质过氧化反应的程度。自由基清除剂SOD等可在缺血后诱导产生。SOD活性的高低反映体内清除氧自由基的能力。GSH-Px的主要作用是清除脂类氢过氧化物和H2O2，保护生物膜及生物大分子免受自由基的损害。抗氧化应激作用是中药发挥治疗脑梗死药效的重要途径。试验结果表明，银杏蜜环口服溶液可显著缩小大鼠脑梗死范围；改善缺血大鼠24 h神经症状可显著，增强血清SOD及GSH-Px活力，降低MDA水平，说明其抗氧化作用是其治疗脑梗死的重要机制之一。

同时试验还观察到，与银杏叶提取物比较，银杏蜜环口服溶液618 mg/kg组SOD活力显著强于18 mg/kg及9 mg/kg组，与天麻蜜环菌比较，银杏蜜环口服溶液618 mg/kg组梗死范围明显小于600 mg/kg组，SOD活力显著强于600 mg/kg和300 mg/kg组，MDA显著低于600 mg/kg和300 mg/kg组，GSH-Px活性显著高于300 mg/kg组。

与银杏叶提取物比较，银杏蜜环口服溶液309 mg/kg组SOD活力显著高于9 mg/kg组；与天麻蜜环菌比较，银杏蜜环口服溶液309 mg/kg组SOD活力显著高于600 mg/kg和组，GSH-Px活性显著高于300 mg/kg组。

银杏蜜环口服溶液的主要组分包括银杏叶提取物和天麻蜜环菌，既往文献表明银杏叶提取物和天麻蜜环菌均具有一定的抗氧化作用[12-15]。本研究发现银杏叶提取物和天麻蜜环菌均具有不同程度的抗氧化作用，而银杏蜜环口服溶液组在治疗脑梗死药效和抗氧化作用方面均显著优于相同剂量下的银杏叶提取物组和天麻蜜环菌组，表明银杏蜜环口服溶液对脑梗死大鼠的抗氧化作用优于单一组分，2种组分间具有协同增效作用，还需进一步进行配伍研究。

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