银杏蜜环口服溶液对缺氧缺糖再灌注诱导脑微血管内皮细胞和SH-SY5Y细胞炎性损伤的保护作用与机制

郑咏秋 张业昊 刘建勋 徐 立 李 磊 王益民 王 勇 王光蕊

(1 中国中医科学院西苑医院,基础医学研究所,北京，100091; 2 西安步长中医心脑病医院,西安,710082)

银杏蜜环口服溶液的组为银杏叶提取物和蜜环菌提取物。其主要作用为:扩张冠状动脉和脑血管,增加冠脉血液流量或者脑部血液流量,同时改善局部微循环及细胞能量代谢,从而起到防止心脑血管的目的[1-2]。在前期本研究团队对脑缺血/再灌注自噬信号通路调控的病理机制研究基础上[3-4],本研究探讨了银杏蜜环口服溶液体外对缺氧缺糖再灌注诱导脑微血管内皮细胞和神经胶质瘤细胞损伤的保护机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 大鼠脑微血管内皮细胞及专用培养液购自Procell公司;SH-SY5Y细胞来自中科院上海细胞库,DEME培养基和胎牛血清购自Gibco公司。

1.1.2 药物 银杏蜜环口服溶液,10 mL/支,批号:160312;银杏叶提取物溶液,10 mL/支,含3 mg银杏叶提取物/ mL和含0.1 g蜜环粉/mL,含3 mg银杏叶提取物/mL;蜜环菌溶液,10 mL/支,含0.1 g蜜环粉/ mL;以上均由邛崃天银制药有限公司提供。研究试验中涉及银杏蜜环口服溶液加样高、中、低剂量分别为50、25、15 μL/mL,折算成含药剂量分别为5.15 mg/mL、2.575 mg/mL、和1.545 mg/mL。同理,蜜环菌溶液,剂量2.5 mg/mL;银杏叶提取物溶液,剂量0.075 mg/mL。

1.1.3 试剂与仪器 HRP标记的山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG购自YUARIO公司;兔抗磷酸化(GR95280-7)和非磷酸化eNOs多克隆抗体、兔抗Caspase3、Beclin-1、LC3I/II抗体购自Abcam公司,兔抗GAPDH抗体购自Sigma-Aldrich公司。IL-1β酶联免疫吸附测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)试剂盒,NEOBIOSCIENCE产品,IL-6 ELISA试剂盒,NEOBIOSCIENCE产品,TNFa ELISA试剂盒,MyBioSource产品。氟化聚偏乙烯(PVDF)微孔转移膜购自Millipore公司。超敏感底物发光试剂盒(SuperSignal West Femto kit),购自Pierce公司。Annexin V/PI双标流式检测试剂盒购自Beyotime InC。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 脑微血管内皮细胞培养于含有10%胎牛血清,青、链霉素各100 μ/mL的Procell脑微血管内皮细胞专用培养基,置37 ℃饱和湿度含5% CO2和95%空气的恒温箱中培养,0.25%胰蛋白酶消化传代。选取对数生长期细胞进行实验。SH-SY5Y细胞培养于含有10%胎牛血清,青、链霉素各100 μ/mL的高糖DMEM 培养基,置37 ℃饱和湿度含5% CO2和95%空气的恒温箱中培养,0.25%胰蛋白酶消化传代。选取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 细胞缺氧缺糖(Oxygen Glucose Deprivation,OGD)再灌注损伤模型的建立 细胞以每孔1×106个的浓度接种于直径35 mm小皿,贴壁24 h后,细胞以无糖Earles平衡盐溶液[无糖OGD液(g/L):NaCl 6.8,KCl 0.4,CaCl2·2H2O 0.264,MgSO4·7H2O 0.2,NaH2PO4·2H2O 0.156,NaHCO32.2]洗涤2次,换成无糖OGD培养液,将细胞置于改良密闭OGD罐内,通以95%N2-5%CO2气体,通气30 min后,置于37 ℃培养箱内继续培养。

脑微血管内皮细胞6 h氧糖剥离后,更换成无血清DMEM培养基再灌注。正常对照采用有糖OGD液(g/L):NaCl 6.8,KCl 0.4,CaCl2·2H2O 0.264,MgSO4·7H2O 0.2,NaH2PO4·2H2O 0.156,NaHCO32.2,葡萄糖1.0培养。SH-SY5Y细胞经4 h氧糖剥离后,更换成无血清DMEM培养基再灌注。正常对照采用有糖OGD液(g/L):NaCl 6.8,KCl 0.4,CaCl2·2H2O 0.264,MgSO4·7H2O 0.2,NaH2PO4·2H2O 0.156,NaHCO32.2,葡萄糖1.0培养。

1.2.3 实验分组及处理 实验分为正常细胞对照组、模型组、各给药组。1)正常对照组:实验时吸出正常培养基,加入正常无血清培养基。2)模型组:吸出正常培养基,加入无血清培养基。3)给药组(不同剂量):模型组分别加入终浓度为5.15 mg/mL(100 μL银杏蜜环口服溶液+1.9 mL无血清培养基)、2.575 mg/mL(50 μL银杏蜜环口服溶液+1.95 mL无血清培养基)和1.545 mg/mL(25 μL银杏蜜环口服溶液+1.975 mL无血清培养基)的银杏蜜环口服溶液、0.075 mg/mL的银杏提取物(50 μL银杏提取物溶液+1.95 mL无血清培养基)和2.5 mg/mL的蜜环提取物(50 μL蜜环菌溶液+1.95 mL无血清培养基)。6 h糖氧剥离后加入药品作用,并立即复糖复氧培养并在24 h后收集活细胞进行凋亡的含量测定。

1.2.4 ELISA法测定细胞上清液IL-1β、TNF-α和IL-6的含量 本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗IL-1β、TNF-α和IL-6单抗包被于酶标板上,标准品和样品中的IL-1β、TNF-α和IL-6与单抗结合,加入生物素化的抗体,形成免疫复合物连接在板上,辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合,加入酶底物TMB,出现蓝色,加终止液硫酸,颜色变黄,在450 nm处测OD值,细胞因子浓度与OD值成正比,可通过绘制标准曲线求出标本中细胞因子浓度。

1.2.5 Western-blot法检测eNOS磷酸化和自噬蛋白表达 采用蛋白裂解液提取胞质蛋白组织于4 ℃,3 000 r/min离心4 min,收集上清,进行Western Blot检测。BCA法测定蛋白含量并定浓度至0.5 mg protein/mL,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),采用相关抗体进行磷酸化和非磷酸化相关蛋白表达检测。增强化学发光(Enhanced Chemiluminescence,ECL)显色。底片曝光。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 收集细胞,每样品配制成5×105/mL悬液,离心去上清,加入195 μL AnnexinV-FITC结合液重悬细胞,加入10 μL PI染色液和5 μL FITC-conjugated Annexin-V进行双重染色20 min。然后在Epic XL流式细胞仪上在488 nm处检测,应用Expo32软件分析数据。

1.3 统计学方法 所有OD值都应减除空白值后再行计算。以标准品1 000、500、250、100、50、25 pg/mL之OD值在半对数纸上作图,画出标准曲线。将浓度作为X轴(对数轴),OD值作为Y轴(线性轴)。曲线应为一光滑曲线。根据样品OD值在该曲线图上查出相应细胞因子含量。实验结果以平均值±标准差表示,数据组件比较采用方差检验,Western Blot图像分析结果采用SPSS软件(Version 11.0)进行非参数检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 银杏蜜环口服溶液对缺氧缺糖/复氧复糖诱导脑微血管内皮细胞上清液炎性反应因子含量的影响 脑微血管内皮细胞在6 h的缺糖缺氧损伤和24 h的再灌注后与对照组比较,其上清液IL-1β、TNF-α和IL-6含量明显升高(P<0.05);分别给予5.15 mg/mL、2.575 mg/mL、和1.545 mg/mL的银杏蜜环口服溶液、0.075 mg/mL的银杏提取物和的2.5 mg/mL蜜环提取物后,发现银杏蜜环口服溶液高、中、低3个剂量组、银杏提取物0.075 mg/mL和蜜环提取物2.5 mg/mL均可抑制上清液TNF-α、IL-1β和IL-6含量,其中银杏蜜环口服溶液中剂量(2.575 mg/mL)对IL-1β和IL-6含量的抑制明显优于银杏提取物(0.075 mg/mL)和蜜环提取物(2.5 mg/mL)。比较之下,银杏蜜环口服溶液大、低剂量组(5.15 mg/mL、1.545 mg/mL)作用较弱,所以在接下来的试验中,将银杏蜜环剂量定为2.575 mg/mL、1.545 mg/mL 2个剂量。见表1。

2.2 银杏蜜环口服溶液对缺氧缺糖/复氧复糖诱导脑微血管内皮细胞自噬信号通路活化的影响 6 h的缺糖缺氧损伤和24 h的再灌注可引起脑微血管内皮细胞凋亡蛋白Caspase3和自噬蛋白Beclin-1表达升高,银杏蜜环口服溶液(1.545、2.575 mg/mL)可明显抑制Caspase3和Beclin-1表达,同时银杏提取物也可抑制Beclin-1表达。模型组eNOS磷酸化水平降低,LC3II/LC3I水平升高,但无统计学意义,其中银杏蜜环口服溶液(1.545、2.575 mg/mL)和其有效组分银杏提取物、蜜环提取物均可明显抑制LC3II/LC3I,银杏蜜环口服溶液(2.575 mg/mL)还可有效提升eNOS磷酸化水平。可见银杏蜜环口服溶液疗效要优于其有效组分银杏提取物、蜜环提取物。见图1～5。

2.3 银杏蜜环口服溶液对缺氧缺糖/复氧复糖诱导SH-SY5Y细胞凋亡的影响 模型组分别加入终浓度为25 μL/mL、15 μL/mL的银杏蜜环口服溶液、25 μL/mL的银杏提取物和25 μL/mL的蜜环提取物。4 h糖氧剥离后加入药品作用,并立即复糖复氧培养并在10 h后收集活细胞进行凋亡的含量测定。

注：与假手术组(正常对照组)比较,**P<0.01;与模型组比较,△P<0.05,△△P<0.01;与银杏提取物比较,▲▲P<0.01;与蜜环提取物比较,□□P<0.01

根据PI/Annexin V双染色采用流式细胞仪分析细胞凋亡率,结果见以下图表所示。从图中可以看出,当采用缺氧缺糖处理细胞后,细胞的凋亡率明显提高(Annexin V+/PI-细胞),其差距具有显著性意义,这说明缺氧缺糖能够促进细胞的凋亡过程。25 μL/mL、15 μL/mL的银杏蜜环口服溶液、25 μL/mL的银杏提取物和25 μL/mL的蜜环提取物可有效减轻缺氧缺糖引发的细胞凋亡,各给药组之间差异无统计学意义。见表2、图6。

图1 银杏蜜环口服溶液对缺氧缺糖/复氧复糖诱导 脑微血管内皮细胞自噬蛋白表达的影响

图2 银杏蜜环口服溶液对缺氧缺糖/复氧复糖诱导脑 微血管内皮细胞自噬蛋白LC3II/LC3I的影响

注：与模型组比较，*P<0.05

图3 银杏蜜环口服溶液对缺氧缺糖/复氧复糖诱导 脑微血管内皮细胞eNOs磷酸化的影响

注：与模型组比较，*P<0.05

图4 银杏蜜环口服溶液对缺氧缺糖/复氧复糖诱导 脑微血管内皮细胞自噬蛋白Beclin-1的影响

注：与假手术组(正常对照组)比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

表2 银杏蜜环口服溶液对缺氧缺糖/复氧复糖 诱导SH-SY5Y细胞凋亡后各亚群 细胞数的影响

注:与正常对照组比较,**P<0.01;与模型组比较,△△P<0.01

图5 银杏蜜环口服溶液对缺氧缺糖/复氧复糖诱导 脑微血管内皮细胞凋亡蛋白Caspase-3的影响

注：与假手术组(正常对照组)比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

图6 流式细胞术测定PI/Annexin V每组典型图片

3 讨论

脑缺血引起的神经元死亡形式主要包括自噬、凋亡和坏死。自噬是溶酶体对细胞内的部分细胞质、细胞器等进行的一系列降解过程的统称。适度的自噬是细胞正常生长发育和稳态维持的重要途径[5]。另一方面,自噬可引起Ⅱ型程序性死亡(Programmed Cell Death Ⅱ,PCDⅡ),又称自噬性细胞死亡(Autophagic Cell Death,ACD),为一种半胱天冬酶(caspase)相关性死亡[6]。本研究深入评价了银杏蜜环口服溶液对缺氧缺糖再灌注诱导脑微血管内皮细胞中eNOs介导的Beclin-1依赖的自噬通路的影响。脑损伤后产生的炎性因子IL-1β、TNF-α和IL-6在神经元坏死、炎性胀亡和接下来的继发性损伤中发挥重要作用,也和细胞自噬过程密不可分。缺血缺氧再灌注后神经元、胶质细胞和脑微血管内皮细胞均可产生炎性因子。本研究采用缺氧缺糖再灌注诱导脑微血管内皮细胞构建糖氧剥离+复糖复氧模型,同时给予不同浓度的银杏蜜环口服溶液及有效组分进行干预,并且通过观察细胞培养上清炎性因子IL-1β、TNF-α和IL-6的浓度和自噬通路的活化,来探讨银杏蜜环口服溶液的脑保护机制。结果表明,银杏蜜环口服溶液高、中、低3个剂量组均可抑制上清液TNF-α、IL-1β和IL-6含量,可明显抑制Caspase3和Beclin-1表达,其中对L-1β和IL-6的作用明显优于银杏叶提取物和天麻蜜环菌。本实验发现银杏蜜环口服溶液可通过促进一氧化氮合酶eNOs的磷酸化来抑制缺糖缺氧再灌引发的细胞凋亡和自噬。同时其中银杏蜜环口服溶液中剂量(2.575 mg/mL)对IL-1β和IL-6含量的抑制明显优于银杏提取物(0.075 mg/mL)和蜜环提取物(2.5 mg/mL)。

[1]李广宣.银杏蜜环口服溶液治疗风痰瘀血证脑梗死临床研究[J].中医学报,2013,28(5):737-738.

[2]韩永鹏,徐佳,朱树建.冠状动脉粥样硬化性心脏病心绞痛银杏蜜环口服溶液治疗分析[J].现代养生(下半月版),2017,32(7):69.

[3]郑咏秋,刘建勋,徐立,等.维脑康及银杏总内酯对局灶性脑缺血再灌注自噬和神经发生作用研究[J].中国中药杂志,2013,38(13):2182-2186.

[4]郑咏秋,姚明江,刘建勋,等.华佗再造浸膏对大鼠局灶性脑缺血/再灌注血脑屏障损伤的保护作用及机制研究[J].中国中药杂志,2013,38(4):585-590.

[5]Zhao J,Zhao Y,Zheng W,et al.Neuroprotective effect of curcumin on transient focal cerebral ischemia in rats[J].Brain Res,2008,1229:224-232.

[6]Zheng YQ,Liu JX,Li XZ,et al.RNA interference-mediated downregulation of Beclin1 attenuates cerebral ischemic injury in rats[J].Acta Pharmacol Sin,2009,30(7):919-927.