南瓜育种相关基础研究进展

郑 扬 张国裕 张 帆 田佳星 张沙沙， 王建书 李海真*

〔1北京农林科学院蔬菜研究中心，农业部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，农业部都市农业（北方）重点实验室，北京 100097；2河北工程大学园林与生态工程学院，河北邯郸 056038〕

南瓜（Cucurbitaspp.）是世界范围内栽培的重要瓜类蔬菜。我国是南瓜生产与消费大国，播种面积和产量均居世界前列，2016年我国南瓜栽培面积42.28万hm2，产量778.94万t，分别占世界总量的21.6%和29.4%（FAO，FAO-Statistics.www.fao.org/）。南瓜易于管理、种植效益好，是农民增收、农村产业发展的重要支柱，种植面积呈递增趋势。但南瓜遗传育种相关基础研究起步较晚，远落后于葫芦科其他主要瓜类蔬菜，限制了育种技术的提升与产业发展。近年来，在科技工作者的努力下南瓜基础研究取得了一些突破性成果。本文从基因组与转录组测序、遗传图谱构建与基因/QTLs定位、种质遗传多样性分析、分子育种等方面进行研究进展概述，并对面临的问题及发展趋势进行展望，旨在为南瓜育种及产业发展提供参考。

1 南瓜基因组与转录组测序

2017年以来南瓜重要的3个栽培种，印度南瓜（C. maxima）、中国南瓜（C. moschata）与西葫芦（C. pepo）全基因组从头测序工作完成并先后释放（Sun et al.，2017；Montero-Pau et al.，2018），组装后基因组大小分别为271.4、269.9 Mb和263.0 Mb，各自包含32 076、32 205个和34 240个基因，标志着南瓜遗传育种与分子生物学研究跨入新的时代，有了高质量参考基因组工具。同时，基因组测序还揭示了南瓜异源四倍化事件，并推测葫芦科内属的分化发生在3 000万年前。结合转录组数据解析了南瓜种间杂种的基因表达变化对杂种优势的贡献。这些研究结果为多倍体基因组进化模型研究和杂交种亲本的选配提供了理论依据。

转录组测序在南瓜上得到了快速应用，除获得海量序列信息与分子标记外（Wu et al.，2014；王洋洋 等，2016；朱海生 等，2018），也鉴别了一些重要性状或生物过程相关基因。Blanca等（2011）首次开展西葫芦转录组测序，鉴别参与抗病、开花与果实品质形成相关的基因，获得大量SSR与SNP标记。翌年，Esteras等（2012）利用转录组测序构建了西葫芦第1张高密度遗传图谱，并对开花、果实形状和颜色等性状进行了QTL分析。Wyatt等（2015，2016）利用转录组测序鉴定了参与西葫芦类胡萝卜素和碳水化合物代谢的关键基因，并认为这些基因的表达调控是影响果实品质的主要因素。王安君等（2016）也开展了中国南瓜与印度南瓜果实中糖、淀粉、类胡萝卜素和肌醇形成相关差异表达基因的研究。一些参与花形成、低温胁迫、果实大小与形状发育、蚜虫吸食防御反应及白粉病诱导的基因也在转录组水平上进行了挖掘鉴定（Guo et al.，2008； 钟 玉 娟 等，2015；Xanthopoulou et al.，2015；Vitiello et al.，2016）。

2 遗传图谱构建及重要基因/QTLs定位

遗传图谱构建及重要基因/QTLs定位是分子育种的基础。早期，利用同工酶、RAPD与AFLP标记构建南瓜遗传图谱，获得与黄果皮基因B、白斑病基因M、裸仁基因n和小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV）抗病基因等连锁的标记，但图谱标记稀少，性状与标记连锁不紧密，标记检测过程繁琐或稳定性差（Weeden＆Robinson，1986；Lee et al.，1995；Brown ＆ Myers，2002；Zraidi＆ Lelley，2004；Zraidi et al.，2007；陈凤珍，2008）。Gong 等（2008a，2008b）开发了大量扩增稳定的SSR标记，先后构建了西葫芦与中国南瓜遗传图谱，并揭示了两者基因组间的线性关系。向成钢（2013）与Ge等（2015）分别构建了包含SSR 标记的印度南瓜遗传图谱，获得与全绿基因gf和瓜皮色基因Rc遗传距离6.3 cM和5.9 cM的SSR标记；南瓜粒宽与耐冷性状也在构建遗传图谱后进行了QTL定位（谭行之 等，2013；Xu et al.，2017）。

高通量测序技术为SSR与SNP标记的大量开发及高密度遗传图谱的构建带来了契机（Esteras et al.，2012）。Zhang等（2015）构建了印度南瓜第1张包含458 个SNPs标记的高密度遗传图谱，鉴定了短蔓候选基因Cma_004516。针对果肉淀粉含量、种子粒长、粒宽等性状也进行了QTL分析（毛晓微，2016）。Montero-Pau等（2017）构建了包含7 718个SNPs标记的西葫芦连锁图，获得与开花、果实品质等性状相关的QTL位点48个。Zhong等（2017）构建了包含3 470个SNPs标记的中国南瓜遗传图谱，将瓜皮色与条纹基因定位在第8连锁群0.31 cM的区域内，获得与果实类胡萝卜素与糖含量、瓜瘤、瓜直径等12个性状相关的QTL位点29个。Kaźm iń ska等（2018）构建了包含1 824个标记的印度南瓜遗传图谱，获得3个控制果肉颜色和类胡萝卜素含量的QTL位点。

另外，赵福宽等（2007）在南瓜上获得与黄瓜花叶病毒（CMV）抗病基因遗传距离为7.1 cM的RAPD标记。李云龙等（2007）获得与中国南瓜短蔓基因遗传距离为2.9 cM的SCAR标记，王深浩等（2011）进一步将连锁标记缩近到1.0 cM。Kabelka和Young（2011）获得与西葫芦银叶病抗病基因（sl）遗传距离3.3 cM 的SSR标记。李智媛等（2011）获得与西葫芦裸仁性状连锁的SCAR标记。高旭（2014）鉴定了与南瓜耐盐、耐涝性状连锁的RAPD和SSR标记。Pachner等（2015）获得3个与籽油用西葫芦ZYMV抗病基因连锁的SSR与SCAR标记，Capuozzo等（2017）获得连锁更为紧密的SNP标记。Kim等（2016）在中国南瓜上开发了与西瓜花叶病毒（WMV）、ZYMV抗性连锁的4个RAPD标记，并转化成功1个SCAR标记。Holdsworth等（2016）将南瓜白粉病抗病基因定位在76.4 kb的区间内。单文琪（2016）获得与印度南瓜强雌性状连锁的分子标记，李海真团队也将该性状定位在57.4 kb的区域内（孙剑飞，2018）。周洋洋等（2018）获得与瓜皮色遗传距离1.86 cM（145.13 kb）的SNP分子标记，并开发了2个dCAPS标记。

3 分子标记辅助选择育种

与南瓜重要性状连锁紧密的分子标记较少，且早期多为RAPD或AFLP标记，操作复杂或扩增稳定性差，应用困难，加之育种单位间技术发展不平衡，真正开展分子标记辅助选择育种的单位较少。Lelley和Henglmuller（2000）利用分子标记进行籽油用西葫芦ZYMV抗病育种。2010年左右先正达将与抗病基因连锁的RAPD标记转化为SNP标记，最早开展KASP高通量标记辅助选择育种，筛查南瓜白粉病与ZYMV病毒病抗性单株。稍后，北京市农林科学院蔬菜研究中心李海真团队也利用自主研发的SSR标记开展白粉病与病毒病抗性育种（李海真 等，2014），并逐步将短蔓、强雌与南瓜类砧木脱蜡粉等性状纳入分子标记辅助选择育种技术体系。Pachner等（2015）也利用SCAR和SSR标记进行籽油用西葫芦ZYMV抗病筛查转育。

4 遗传多样性研究

遗传多样性研究可以揭示不同种质材料间的遗传变异程度，为种质资源的科学分类及育种选择提供依据。早期利用同工酶、RAPD标记、细胞器DNA揭示南瓜3个主要栽培种中，中国南瓜遗传多样性与西葫芦相似，高于印度南瓜（Jobst et al.，1998；Baranek et al.，2000）。Paris等（2003）利用分子标记将45份西葫芦材料分成3个类群（pepo、ovifera和fraterna），并揭示后两者亲缘关系更近，且栽培种内具有丰富的遗传变异。后来，Gong等（2012）也将100份西葫芦材料分成这3个类群，并推测聚类在2个栽培种间的4份材料为未被驯化 的 野 生 种。Ferriol等（2003a）、Formisano等（2012）分别利用SRAP、AFLP和EST-SSR标记将西班牙的69份南瓜商品种和地方品种分为2个亚类pepo和ovifera，认为地方品种中存在的丰富有利遗传变异未被广泛利用。希腊与南非的西葫芦地方品种也利用分子标记进行了多样性分析（Ntuli et al.，2015；Xanthopoulou et al.，2015）。利用RAPD和SBAP标记，Ferriol等（2003b）将西班牙的印度南瓜地方品种也分为了3个类群。Kaźm iń ska等（2017）利用SSR标记对85份来源于不同国家的印度南瓜种质材料进行了多样性分析。Kong等（2014）报道砧用南瓜商品种多为印度南瓜与中国南瓜种间杂交种，且砧用中国南瓜自交系间存在可利用的高遗传变异。Gwanama 等（2000）将非洲中南部31份中国南瓜地方品种划分为4个类群。Barboza等（2012）分析了中美洲地区的218份中国南瓜，认为来源于墨西哥的材料较来源于尼加拉瓜、危地马拉和巴拿马的材料多样性更为丰富。

国内，Wu等（2011）采用AFLP标记对74份来源于中国、15份来源于其他国家的中国南瓜进行分析，来源于中国的材料被分为2类，与印度和日本的资源相近，明显有别于墨西哥、危地马拉、洪都拉斯和厄瓜多尔的资源。李俊丽等（2005）与卢丽芳等（2015）均利用分子标记将南瓜材料分成中国南瓜、印度南瓜与西葫芦3大类群。云天海等（2013）应用ISSR和SRAP标记对28 份海南南瓜农家品种的遗传特异性进行分析，构建了指纹图谱。王瑞等（2016）利用SSR标记将95份南瓜材料分成3个类群；王迎儿等（2017）将浙江省41份南瓜材料分成4个类群。另外，南瓜丰富的表型变异特征也被用以种质遗传多样性研究（Tsivelikas et al.，2009；Balkaya et al.，2010； 杨 正 安 等，2011；屈淑平 等，2013；李鹤 等，2014；郁永明 等，2014；郑道君 等，2016；Darrudi et al.，2018）。

5 转基因育种

针对病毒病的严重危害，美国1995年释放了第1个转ZYMV外壳蛋白基因的西葫芦抗病品种，翌年又释放了可以同时抵御ZYMV、WMV和CMV 3种病毒侵害的转基因西葫芦品种（Fuchs &Gonsalves，1995；Tricoli et al.，1995；Fuchs et al.，1998），后又培育出抗南瓜花叶病毒（SqMV）的转基因西葫芦品种（Provvidenti＆ Tricoli，2002）。Shah等（2008）以西葫芦茎尖为外植体，同时转化2个载体，转化效率为0.7%。Nanasato等（2011，2013）以中国南瓜子叶节为受体，初始获得2.7%遗传转化效率，后来提高到9.2%，而西葫芦、印度南瓜与黑籽南瓜的转化效率较低，仅为 0.2%～0.3%， 但 Ram í rez-Ortega等（2015） 却在印度南瓜上获得17.6%～56.0%的高转化率。国内在南瓜转基因方面也进行了不断探索。王晶晶等（2007）成功将菜豆几丁质酶基因经农杆菌介导导入南瓜中。李长生等（2009）对黑籽南瓜农杆菌转化的适宜条件进行了研究。付洪冰等（2010）利用根瘤农杆菌侵染南瓜子叶节，成功获得转化率为0.56%的阳性植株。张言朝等（2012）利用子房注射法获得转化aiiA基因的阳性株，转化率为 0.25%。

6 单倍体育种

双单倍体技术可以显著提高优良株系纯化速度，提高育种效率。Chambonnet＆Dumas（1985）培养西葫芦未受精胚珠，获得单倍体与二倍体的嵌合植株。随后，Metwally等（1998）探索了低温预冷（4 ℃）和培养基处理对开花前1 d胚珠培养的影响，获得西葫芦单倍体和双单倍体植株。同年，Metwally等利用花药培养也获得西葫芦单倍体植株。Shalaby（2007）培养西葫芦子房切片，再生植株中35%为单倍体，剩余为双单倍体。Kurtar等（2018）对印度南瓜和中国南瓜进行大孢子培养，可获得37.7%的双单倍体诱导率。国内很多学者也对大孢子培养获得单倍体的条件进行了探索，并得到西葫芦（陈学军 等，2000；郭永强 等，2004；谢冰 等，2006；徐静，2007；刘栓桃 等，2008；葛志东，2009）与中国南瓜（翟庆慧，2009；孙守如 等，2013；闵子扬 等，2016）单倍体植株。另外，Kurtar等（2002）、Kurtar和 Balkaya（2010）利用辐射花粉诱导途径获得西葫芦单倍体，诱导率为幼胚的1.17%，Košmrlj等（2013）也获得类似结果。国内，许利彩等（2009）和苏敏等（2011）利用辐射花粉诱导西葫芦单倍体，获得5.08%～7.40%的诱导率。单倍体诱导效率及稳定性还需进一步提高，同时受体材料基因型间的差异也需克服。

7 存在问题及展望

目前我国南瓜育种基础研究面临的主要问题有：研究起步晚，长期投入少，研究深度不够，创新性不足；各单位发展不平衡，基础研究带来的新技术、新方法在育种上应用少，对育成品种的贡献率低，还没有起到引领推动南瓜育种技术提升及产业发展的作用。因此，今后应该在以下几个方面做出努力：

① 加强基因组、转录组数据的利用。南瓜组学研究还处于发展初期，海量研究数据会不断涌现，深入开展比较基因组学、结构基因组学、功能基因组学以及转录组研究，在基因组水平对种质资源进行深入鉴定及对重要功能基因进行快速发掘，为新品种选育提供指导。

② 加快分子设计育种体系建设，创制突破性南瓜新品种。在重要性状控制基因不断发掘的基础上加强应用平台建设，实现分子育种与常规育种技术的紧密结合，实现优良基因的最佳配置，提高多目标性状同步改良的效率，将传统育种逐步向现代分子育种转变，提升我国南瓜育种技术水平，增强国际竞争力，以种质资源创新、新品种培育为突破口，为产业发展提供保证。

③ 争取在单倍体育种与转基因育种上有所突破。克服目前南瓜双单倍体诱导及转基因效率低的问题，实现双单倍体育种应用，提高优良株系纯合速度；提高遗传转化效率，做好基因工程育种包括基因编辑系统的技术储备研究。