费氏丙酸杆菌生物学特性及与5株益生菌拮抗性试验研究

陈桂芳,刘 艳,,单春乔,冯柳柳,宋 凡,江国托,*

(1.江苏三仪生物工程有限公司,江苏 邳州 221300；2.大连三仪动物药品有限公司,辽宁 大连 116036)

丙酸杆菌属(Propionibacteriumspp.,PB)是厌氧或耐氧的革兰氏阳性菌,不运动,不产生芽孢,在温度为30～37℃、pH接近7的环境中繁殖速度最快[1]。研究表明,丙酸杆菌能够促进双歧杆菌生长；产生细菌素等物质抑制致病菌的繁殖；利用乳酸产生丙酸,而丙酸作为前体物质可以通过糖异生作用生成葡萄糖,为机体提供能量[2-4]。费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii,PF)是丙酸杆菌的一种,属于食品级微生物,我国于2010年将其列入《可用于食品的菌种名单》中[5]。ANGELOPOULOU A等[6]首次将费氏丙酸杆菌作为益生菌加入白纹奶酪中制成了益生羊乳酪,同时发酵产生的丙酸和乙酸也能够促使结肠癌细胞的凋亡。RYZHKOVA E P等[7]研究发现,费氏丙酸杆菌能够产生抑制细菌和真菌的多肽类物质,用于食品的保鲜。杜葳等[8]研究了一种费氏丙酸杆菌细胞离位转化生产维生素B12的方法,使维生素B12的产量达到108.06 mg/L。ABURJAILE F F等[9]研究发现,费氏丙酸杆菌通过降低氧化磷酸化作用、糖酵解和Wood-Werkman循环等调节营养不良患者的新陈代谢活动。目前国内外对费氏丙酸杆菌的研究主要集中在食品酸奶发酵剂和其对人类的益生作用方面,对其生物学特性和与别的益生菌间的拮抗作用的研究鲜有报道。

为了评价费氏丙酸杆菌的益生菌特性,本研究以费氏丙酸杆菌为对象,采用平板计数法研究其抑菌性、耐酸性、耐胆盐和耐高温等生物学特性,并通过平板划线法研究其与别的益生菌间的拮抗作用,以期为该菌的应用提供理论依据,并为其工业化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus):江苏三仪生命科学研究院分离并保藏。

1.1.2 培养基及试剂

水或乳糖肉汤(saline lactose broth,SLB)培养基:胰蛋白胨1%,酵母粉1%,葡萄糖2%,K2HPO40.025%,MnSO4·H2O 0.005%；营养琼脂培养基:绍兴天恒生物科技有限公司；MRS培养基:葡萄糖2%,蛋白胨1%,酵母粉1%,牛肉膏0.5%,K2HPO40.2%,柠檬酸铵0.2%,无水乙酸钠0.5%,MgSO4·7H2O 0.058%,MnSO4·H2O 0.025%,吐温-80 0.1%；丁酸梭菌专用培养基:根据参考文献[10]配制；以上培养基添加1.5%琼脂粉即为其固体计数培养基。胆盐:北京索莱宝科技有限公司；盐酸、氢氧化钠(分析纯):国药集团化学试剂有限公司；革兰氏染液试剂盒:南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

YQX-1型厌氧培养箱:上海跃进医疗器械有限公司；HPX-9272数显电热培养箱:上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-2F型双人双面净化工作台:上海沪粤明科学仪器有限公司；TGL-16B高速台式离心机:上海安亭科学仪器厂；GI54DWS立式高压灭菌锅:致微(厦门)仪器有限公司；Nikon E100生物显微镜:上海尼康仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 费氏丙酸杆菌的性状

取适量费氏丙酸杆菌菌粉溶解于无菌SLB液体培养基中,37℃厌氧静置培养48 h,划线,37℃厌氧恒温箱中培养72 h,观察其菌落形态并进行革兰氏染色。

1.3.2 体外混合培养对病原菌的抑制作用

[11-12],取培养好的大肠杆菌和费氏丙酸杆菌菌液接入SLB液体培养基中,使大肠杆菌和费氏丙酸杆菌的初始活菌数相同,37℃静置培养,于接种培养0、12 h、24 h、36 h和48 h时分别取样,对费氏丙酸杆菌和大肠杆菌进行菌落计数,并设单独培养为对照。沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的测定方法同上。

1.3.3 耐酸性试验

将培养48h的费氏丙酸杆菌菌液按1%的接种量转接到5 mL新鲜SLB液体培养基中,37℃静置培养至OD600nm=1.0,离心收集菌体,弃掉培养基。将菌体悬浮在pH值为2.0、2.5、3.0的SLB液体培养基中,37℃继续培养0、1 h、2 h和3 h后,等比稀释,涂布SLB平板,活菌计数,每个试验重复3次,求其平均值。

1.3.4 耐胆盐试验

方法同耐酸性试验,不同之处在于,将菌体悬浮在牛胆盐含量为0.03%、0.10%、0.20%、0.30%的SLB液体培养基中,37℃继续培养0、2 h、4 h和6 h后,进行活菌计数。

1.3.5 耐高温试验

参考陈新亮等[13]的方法,并作相应修改。取培养48 h的菌株分别于45℃、50℃、55℃、60℃水浴中处理20 min,以不作高温处理的菌株作为对照组。进行平板计数,计算菌株存活率,其计算公式如下:

1.3.6 与其他益生菌拮抗性试验

参考范利霞[14]的方法进行拮抗性试验,对费氏丙酸杆菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、丁酸梭菌和凝结芽孢杆菌分别进行编号1、2、3、4、5,其中费氏丙酸杆菌用SLB培养基；粪肠球菌和凝结芽孢杆菌用MRS琼脂平板；枯草芽孢杆菌用营养琼脂平板；丁酸梭菌用专用培养基。

1.3.7 数据分析

采用Origin8.0绘图,SPSS19.0统计软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 费氏丙酸杆菌的性状

由图1A可知,费氏丙酸杆菌是革兰氏阳性菌,短杆状,菌落0.2～0.5 mm,圆形,凸面到垫状,半不透明,闪光,淡黄色。由图1B可知,在显微镜下,费氏丙酸杆菌呈短杆状,细胞单个、成对或短链,呈“V”或“Y”字形出现,这与《伯杰氏系统细菌学手册》的描述相一致。

图1 费氏丙酸杆菌的菌落形态(A)和细胞形态(B)Fig.1 Colonial(A)and cell(B)morphology ofP.freudenreichii

2.2 抑菌作用

大多数益生菌对致病菌具有较好的抑制作用。费氏丙酸杆菌(PF)对致病菌的抑制作用结果如图2所示。由图2A可知,当与大肠杆菌共培养时,费氏丙酸杆菌随着培养时间的延长呈对数生长,其活菌数对数与对照组没有差异性(P＞0.05)；实验组大肠杆菌在36 h和48 h活菌数略有降低,但均未达到1个数量级,可见其对大肠杆菌的抑制作用不明显(P＞0.05)；由图2B可知,当与沙门氏菌共培养时,费氏丙酸杆菌随着培养时间的延长呈对数生长,其活菌数对数与对照组没有差异性(P＞0.05)；实验组沙门氏菌在12 h和24 h活菌数对数比对照组略有降低,但是36 h和48 h又与对照组相同,因此和大肠杆菌相似,费氏丙酸杆菌对沙门氏菌也没有明显的抑制作用；由图2C可知,当与金黄色葡萄球菌共培养时,费氏丙酸杆菌的活菌数对数与对照组差异不显著(P＞0.05)；从24h开始,实验组金黄色葡萄球菌活菌数对数明显低于对照组(P＜0.01),且差异性逐渐增大,在48 h时活菌数差异性最大(P＜0.01),达2个数量级,可见费氏丙酸杆菌对金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用。

图2 费氏丙酸杆菌对大肠杆菌(A)、沙门氏菌(B)和金黄色葡萄球菌(C)的抑制作用Fig.2 Results of inhibiting the growth ofEscherichia coil(A),Salmonella(B)andStaphylococcus aureus(C)

2.3 耐酸性试验

益生菌要在胃肠道中保持一定的存活数量,耐酸性是一个重要特性。动物和人胃液的pH值在3.0左右,而食物在胃中消化的时间一般为1～2 h[15-16]。对费氏丙酸杆菌的耐酸性进行了评价,结果如图3所示。由图3可知,随着pH值下降和时间上升,费氏丙酸杆菌活菌数呈现下降的趋势,在pH值为2.0的环境中培养3h,活菌数降到最低为7.01lg(CFU/mL),活菌数只下降了一个数量级,说明费氏丙酸杆菌具有很好的酸耐受性。另外,无论pH为2.0、2.5还是3.0,活菌数在1h内从8.37 lg(CFU/mL)分别降低至7.66、7.72和7.90 lg(CFU/mL),之后的2～3 h仍维持在7.00 lg(CFU/mL),说明费氏丙酸杆菌抗逆性强,对酸性环境表现出较强的适应能力。费氏丙酸杆菌的耐酸性能力类似于乳酸菌,其较强的耐酸能力是在肠道定植生长的关键要素。CAMPANIELLO D等[17]研究发现,费氏丙酸杆菌能够耐受pH=2.5的胃环境,并在胃肠道中的定植发挥益生作用,和本研究结果相似。

图3 费氏丙酸杆菌的耐酸性试验结果Fig.3 Results of acid tolerance tests ofP.freudenreichii

2.4 耐胆盐试验

益生菌对胆盐的耐受能力是决定其能否在肠道存活、定植并发挥功效的首要条件之一。菌株本身的特性和胆盐的浓度是影响其耐受能力的主要因素。肠道中胆盐的质量分数在0.03%～0.30%范围内波动[16],因此,通过研究益生菌株在不同浓度胆盐中的生长情况,可以评价该菌株的耐胆盐能力[18-19]。对费氏丙酸杆菌的胆盐耐受特性的研究,结果如图4所示。

图4 费氏丙酸杆菌的耐胆盐试验结果Fig.4 Results of bile salt tolerance tests ofP.freudenreichii

由图4可知,费氏丙酸杆菌在各胆盐含量中培养6 h,活菌数都保持在原来的数量级,可见费氏丙酸杆菌具有较强的胆盐耐受活性,可以顺利通过小肠。在胆盐含量为0.03%的环境中,菌株对胆盐的耐受性最强,在该胆盐含量环境中培养6h菌株存活率为36.47%。而在0.10%、0.20%和0.30%的胆盐含量坏境中,培养6h后存活率分别为32.09%、23.97%和18.67%。

2.5 耐高温试验

益生菌制剂是活菌制剂,对温度、压力、pH值等外界环境较敏感,这将促使在饲料制粒过程的高温高压条件下其活性受到一定的损失,严重影响使用效果[20]。因此耐高温活性强的益生菌能够提高在饲料加工过程中存活率。温度对费氏丙酸杆菌的影响结果如表1所示。由表1可知,45℃处理20 min,存活率为53.6%；温度上升至55℃时,费氏丙酸杆菌活菌数下降达到一个数量级,存活率变为30.6%；温度继续上升为60℃时,存活率下降至12%,这说明费氏丙酸杆菌对温度有一定的耐受能力,但耐受力低于芽孢杆菌和一些乳酸菌[21],该结果为费氏丙酸杆菌后期的包被材料和干燥方式的选择提供了参考依据。

表1 费氏丙酸杆菌的耐高温试验结果Table 1 Results of high-temperature tolerance tests ofP.freudenreichii

2.6 与其他益生菌拮抗性试验

考虑到不同菌株在不同培养基中生长情况不同,选择分别研究每种菌株在其最适培养基上与其他4株菌的拮抗作用,然后分析菌株之间的作用效果。5株益生菌间的拮抗性试验,结果如图5所示。由图5A可知,费氏丙酸杆菌与其他4株菌划线相交处菌落连续,表明费氏丙酸杆菌与其他4株菌无拮抗作用,可见费氏丙酸杆菌可以与常用益生菌配伍使用,从而更大程度的发挥益生菌间的复合益生效果；由图5B可知,枯草芽孢杆菌与其他3株菌划线相交处菌落连续,与丁酸梭菌划线相交处菌落不连续,表明枯草芽孢杆菌与费氏丙酸杆菌、粪肠球菌和凝结芽孢杆菌无拮抗作用,与丁酸梭菌有拮抗作用；由图5C可知,粪肠球菌与其他4株菌划线相交处菌落连续,表明粪肠球菌与其他4株菌无拮抗作用；由图5D可知,丁酸梭菌同其他3株菌划线相交处菌落连续,与枯草芽孢杆菌划线相交处不连续,表明丁酸梭菌与费氏丙酸杆菌、粪肠球菌和凝结芽孢杆菌无拮抗作用,与枯草芽孢杆菌有拮抗作用；由图5E可知,凝结芽孢杆菌与其他4株菌划线相交处菌落连续,表明凝结芽孢杆菌与其他4株菌无拮抗作用。因此,在益生菌复配过程中,应考虑到丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌间的拮抗作用提高复合微生态制剂的益生活性；而其余菌株间没有拮抗作用,可进行配伍获得更强益生效果的复合益生菌剂。

图5 益生菌间的拮抗性试验结果Fig.5 Results of antagonism tests between probiotics

2.7讨论

2.7.1 益生菌耐受性

影响益生菌在肠道内定植的主要因素为低酸度和胆汁酸盐的浓度[22-23]:动物和人类胃液pH值通常在3左右,具有很强的杀菌作用,因而具有耐酸能力的益生菌才能在消化道内生长繁殖并发挥作用；而胆汁酸盐通过分解细菌细胞壁中的脂肪,使细菌失活,耐胆盐能力越强的益生菌,其在肠道内的存活几率越大,因此人们需要全面考虑菌株的生物学特性才能筛选出性状良好的益生菌种[12,24-25]。本试验结果表明费氏丙酸杆菌具有一定的耐酸和耐高温特性以及较强的胆盐耐受能力。欧洲食品组织认定费氏丙酸杆菌是不具有耐药性和毒力因子的安全性菌株[3],因此费氏丙酸杆菌可以作为益生菌添加到人类膳食中。结果还表明费氏丙酸杆菌对金黄色葡萄球菌具有很好的抑制作用,但是具有抑菌作用的产物类型尚不完全清楚,抑菌机制亦有待深入研究。

2.7.2 益生菌间拮抗性试验

生物拮抗作用是生物之间的竞争性排斥、干扰和抑制等作用[26]。益生菌的生物拮抗作用有两方面的表现:益生菌与致病菌以及益生菌与益生菌的拮抗作用。研究益生菌间的生物拮抗作用是制备复合微生态制剂的前提。丁酸梭菌与枯草芽孢杆菌间有拮抗作用,这说明这两种益生菌不适合配伍制备复合微生态制剂。费氏丙酸杆菌与粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌和凝结芽孢杆菌均没有拮抗作用,可以复配使用,这为费氏丙酸杆菌的工业化应用提供了新方向。当然,对于费氏丙酸杆菌具体的益生效果需要通过临床试验进一步来验证。

3 结论

费氏丙酸杆菌在体外共培养时,对金黄色葡萄球菌具有显著的抑制作用(P＜0.01),且具有一定的耐酸性和很强的耐胆盐活性,在胆盐含量为0.3%的条件下培养6 h存活率达18.67%。费氏丙酸杆菌对高温能力耐受能力较弱,在60℃条件下维持20 min,存活率下降为12.0%。拮抗性实验结果表明,费氏丙酸杆菌与枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、凝结芽孢杆菌和丁酸梭菌均没有拮抗作用。因此,费氏丙酸杆菌作为具有益生特性的食品微生物,可以作为微生态制剂单独或者与其他益生菌配伍,应用在动物和人类健康中。

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