费氏弧菌综合毒性法对不同种类污染物的应急监测试验研究

李 汝，逯南南，李 梅，宋武昌，孙韶华，贾瑞宝

(1.山东建筑大学市政与环境工程学院，山东 济南 250101；2.山东省城市供排水水质监测中心，山东 济南 250021)

费氏弧菌综合毒性法对不同种类污染物的应急监测试验研究

李 汝1,2，逯南南2，李 梅1，宋武昌2，孙韶华2，贾瑞宝2

(1.山东建筑大学市政与环境工程学院，山东 济南 250101；2.山东省城市供排水水质监测中心，山东 济南 250021)

以突发水环境污染事件中常见的重金属、农药和工业有机物三大类污染物为研究对象，利用海洋发光菌费氏弧菌进行发光菌综合毒性法试验研究。结果表明：采用冻干菌粉快速复苏技术对重金属、农药和工业有机污染物进行应急监测时，与发光菌的接触时间可用10 min代替传统的推荐接触时间15 min；重金属、农药以及工业有机污染物对费氏弧菌的发光抑制率随特定污染物浓度增加而增大，不同特定污染物对费氏弧菌的影响程度不同，可实现发光菌综合毒性法进行水质应急监测。

费氏弧菌；综合毒性法；发光抑制率；水质应急监测技术；重金属；农药；工业有机污染物

在环境污染突发事件中，污染源以及污染物一般具有不确定性[1]，水质应急监测以及水质预警需要比普通理化分析方法更快速、更灵敏的监测手段[2-4]。发光细菌(也称发光菌)综合毒性法[5]就是基于发光菌光效应在450～490 nm波长下发射可见荧光的生理特性进行的一种灵敏度高、相关性好、反应速度快、自动化程度高的生物毒性监测方法[6-7]。

自1672年Boyle开始研究发光菌的发光受化学物质抑制以来，1976年Hastings、Wilson以提出了有机物对发光菌发光抑制效应及毒性作用机制[8]，促进了生物毒性监测的发展，随后美国Beckman仪器公司研制了生物毒性测试系统(Microtox)以及便携式毒性测定仪(Deltatox)，荷兰microLAN B.V.公司研制了基于费氏弧菌的在线毒性测定仪(TOXcontrol)以及便携式毒性测定仪(Check Light)等[9-10]。1995年，我国颁布了应用发光菌进行水质毒性测试的国家标准，大量学者也利用发光菌的不同种类进行了重金属、有机溶剂、除草剂等的毒性评价，并研究了最佳测试条件、毒性与污染物的相关性等[11-15]。基于上述研究，本文以突发水环境污染事件中常见的重金属、农药和工业有机污染物三大类污染物为研究对象，选取海洋发光菌(费氏弧菌)对二价锌(Zn2+)、六价铬(Cr6+)、二价铜(Cu2+)、马拉硫磷、百菌清、苯酚和四氯化碳等不同种类污染物进行费氏弧菌的生物综合毒性检测，从而得出费氏弧菌对不同种类污染物的敏感性差异、不同作用时间的发光抑制率以及适用于水质应急检测的作用时间。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

受试菌种：中科院南京土壤微生物所提供费氏弧菌(Vibriofischeri)冻干粉。

菌种复苏稀释液：与费氏弧菌冻干粉配套。

培养装置：TOX bioshaker细菌培养发生器(荷兰MicroLAN B.V.公司)。

检测设备：Check Light-TOX-Screen3水质毒性检测仪(荷兰MicroLAN B.V.公司)。

特定污染物：ZnSO4、K2Cr2O7、CuSO4、马拉硫磷、百菌清、苯酚、四氯化碳，均为优级纯。

毒性物质浓度设定：配置母液Zn2+为100 mg/L、Cr6+为100 mg/L、Cu2+为50 mg/L、马拉硫磷为10 mg/L、百菌清为50 mg/L、苯酚为50 mg/L、四氯化碳为10 mg/L。各污染物的浓度系列设定见表1。

表1 污染物浓度系列设定(mg/L)

1.2 试验方法

1.2.1 费氏弧菌的复苏

将储存在-20℃下的费氏弧菌冻干粉与菌种复苏稀释液混合，放置于TOX bioshaker细菌培养发生器上振荡培养15 h[15-16]，目的是获得发光度高、相对稳定且灵敏度高的费氏弧菌悬液；然后吸取0.1 mL费氏弧菌悬液测定其原始发光量(I0)，需要发光强度大于500 000[17-18]。

1.2.2 费氏弧菌悬液样品的预处理

采用不同污染物配制母液，试验过程中进行不同梯度的稀释，并调节测试样品的渗透压，即NaCl浓度为2%。

1.2.3 综合毒性测试方法

试验采用菌种复苏稀释液作为试验空白与不同测试样品用枪头混合均匀后，在0 min、5 min、10 min、15 min时测定其发光强度，并记录其读数。由于测试时间内对照样品发光强度会发生改变，因此需按照下面公式计算测试样品的发光抑制率[18-20]:

(1)

ICt=IS0·fk(t=5min、10min、15min)

(2)

(t=5min、10min、15min)

(3)

式中：fk为修正系数；IR5、IR10、IR15分别为5min、10min、15min后对照样品的发光强度(cd);IR0、IS0分别为对照样品和测试样品的初始发光强度(cd)；ISt、ICt分别为不同时刻测试样品的发光强度和修正发光强度(cd)。

利用试验所得的费氏弧菌的发光抑制率与污染物浓度作发光抑制作用曲线，获得曲线拟合方程，并可求得发光菌的半致死率EC50。

2 结果与讨论

2.1 不同种类污染物与费氏弧菌不同接触时间的毒性比较

有毒污染物进入发光菌生存环境后，通过直接抑制细菌发光反应过程的酶活性，或是抑制细菌体内发光反应相关的代谢反应进而抑制菌体发光强度。本试验通过测定不同浓度污染物与费氏弧菌接触时间在5min、10min、15min下的发光抑制率，来确定不同种类污染物与费氏弧菌接触反应的合适时间。

2.1.1 重金属类污染物

图1至图3为重金属类不同浓度污染物Zn2+、Cr6+、Cu2+与费氏菌接触时间为5min、10min、15min时的发光抑制作用曲线。由图1至图3可见：重金属类污染物Zn2+、Cu2+与费氏弧菌接触时间为10min、15min时的发光抑制作用曲线接近，且略高于接触时间5min时的发光抑制作用曲线；重金属类污染物Cr6+与费氏弧菌接触时间为5min、10min、15min时的发光抑制作用曲线具有平行性，且接触时间越长发光抑制率越大。

2.1.2 农药类污染物

图4和图5为农药类不同浓度污染物马拉硫磷、百菌清与费氏弧菌接触时间为5min、10min、15min时的发光抑制作用曲线。由图4和图5可见：农药类污染物马拉硫磷、百菌清与费氏弧菌接触时间为10min、15min时的发光抑制作用曲线接近，且具有平行性；农药类污染物低浓度下5min测定费氏弧菌发光抑制率较10min、15min的发光抑制率偏高，农药类污染物高浓度下5min测定费氏弧菌发光抑制率较10min、15min的发光抑制率略低。

2.1.3 工业有机污染物

图6和图7为工业有机污染物苯酚、四氯化碳与费氏弧菌接触时间为5min、10min、15min时的发光抑制作用曲线。由图6和图7可见:工业有机污染物苯酚、四氯化碳与费氏弧菌接触时间为5min、10min、15min时的发光抑制作用曲线在较高浓度下接近，具有一致性；在低浓度下10min、15min时的发光抑制率接近，且略高于5min。

2.2 不同种类污染物对费氏弧菌的急性毒性作用

有毒有害污染物进入水体，费氏弧菌发光强度受到抑制，其发光抑制率与污染物浓度具有一定比例关系。本试验基于不同种类污染物与费氏弧菌不同接触时间的毒性效应进行比较，此阶段试验采用污染物与费氏弧菌的接触反应时间为10min进行。

2.2.1 重金属类污染物

重金属类污染物Zn2+、Cu2+、Cr6+对费氏弧菌的毒性效应见图8。由图8可见，Zn2+浓度为3mg/L

时对费氏弧菌的发光抑制率达到49.5%，Zn2+浓度为5mg/L时高达91.5%；Cu2+浓度低于1mg/L时对费氏弧菌的发光抑制率在28.2%以下，Cu2+浓度为5mg/L时高达62.18%；Cr6+浓度为70mg/L时对费氏弧菌的发光抑制率也低于50%。上述试验结果充分说明，重金属类污染物在较低浓度下，对费氏弧菌的毒性效应增长较快，随着污染物浓度的增加，其对费氏弧菌的毒性效应增长趋于稳定，且毒性效应增长速度表现为：Zn2+>Cu2+>Cr6+。

2.2.2 农药类污染物

农药类污染物作用于费氏弧菌，可抑制菌体发光效应。农药类污染物马拉硫磷、百菌清对费氏弧菌的毒性效应见图9。由图9可见，马拉硫磷、百菌清对费氏弧菌的发光抑制率随污染物浓度的增加而逐渐增大。与其他类污染物相比，农药类污染物对费氏弧菌的毒性效应随污染物浓度增加而增大的程度更快，这是因为马拉硫磷、百菌清分别属于有机磷类、取代苯类农药，费氏弧菌对有机磷类农药更为敏感。

2.2.3 工业有机污染物

工业有机污染物苯酚、四氯化碳对费氏弧菌的毒性效应见图10。由图10可见，工业有机污染物苯酚、四氯化碳在不同浓度下，可造成费氏弧菌发光抑制率的变化，污染物浓度与费氏弧菌发光强度具有一定的负相关性；苯酚对费氏弧菌的毒性效应小于四氯化碳。

2.3 不同种类污染物对费氏弧菌的毒性评价

不同种类污染物对费氏弧菌发光效应的正常代谢会造成影响，表现为污染物浓度越大，发光抑制程度越大，即费氏弧菌的发光抑制率与污染物浓度呈正相关。发光菌的发光强度抑制率反映污染物对发光菌的毒性大小，而发光菌的半致死率(EC50)反映发光菌对污染物的敏感程度大小，故发光菌的EC50越小，说明发光菌对污染物越敏感，污染物对发光菌的毒性越大。表2为不同污染物与费氏弧菌接触时间为10min和15min时的发光抑制作用曲线的拟合方程和EC50。由于Cr6+浓度在70mg/L时对费氏弧菌的发光抑制率已低于50%，故K2Cr2O7对费氏弧菌的发光抑制作用曲线方程拟合不能较准确地反映六价铬浓度对费氏弧菌发光抑制率的趋势，且EC50>70mg/L，可见费氏弧菌对Cr6+的敏感性低于Zn2+、Cu2+。锌元素本身是生物体发育成长所需的微量元素，其对费氏弧菌的发光抑制作用曲线的拟合方程与其他污染物不具有一致性。通过对相同接触时间不同种类污染物的EC50进行比较，可得出费氏弧菌对不同种类污染物的敏感性顺序如下：重金属类污染物为Zn2+>Cu2+>Cr6+；农药类污染物为马拉硫磷>百菌清；工业有机污染物为四氯化碳>苯酚。即不同种类污染物对费氏弧菌毒性作用排序如下：重金属类污染物为Zn2+>Cu2+>Cr6+；农药类污染物为马拉硫磷>百菌清；工业有机污染物为四氯化碳>苯酚。此外，通过对同一污染物与费氏弧菌接触时间为10min和15min的EC50进行比较，可得出除营养元素锌外，污染物与费氏弧菌接触时间为10min时的EC50均大于或略大于15min时的EC50。

表2 不同污染物与费氏弧菌接触时间为10 min和15 min时的发光抑制作用曲线的拟合方程和半致死率(EC50)

3 结 论

(1) 比较污染物与费氏弧菌不同接触时间的发光抑制作用曲线，可见不同种类污染物10 min与15 min发光抑制作用曲线接近，具有一定的平行性，在应急监测中为提高应急效率，可以选择污染物与费氏弧菌的接触时间为10 min。

(2) 比较三类污染物对费氏弧菌的毒性作用曲线，可见污染物对费氏弧菌的发光抑制率随污染物浓度增加而增大，重金属类污染物对发光菌的发光抑制作用曲线与农药类污染物、工业有机污染物相比其斜率较大，即说明费氏弧菌对重金属类污染物较敏感。

(3) 根据各污染物对发光菌的发光抑制作用曲线拟合方程所得的半致死率(EC50)，可得出费氏弧菌对不同污染物的敏感程度排序和污染物对费氏弧菌的急性毒性作用排序：重金属类污染物为Zn2+>Cu2+>Cr6+；农药类污染物为马拉硫磷>百菌清；工业有机污染物为四氯化碳>苯酚。除营养元素锌外，污染物与费氏弧菌接触时间为10 min时的EC50大于或略大于15 min时的EC50。

(4) 费氏弧菌应急监测是一种快速筛选生物毒性的综合毒性法，其反应速度快、准确度较高，适合作为水质常规监测技术的补充手段，并在快速检测中有着广泛应用前景，对保障水质安全具有指导意义。

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Experiment Study of the Emergency Monitoring on Different Types of Pollutants byVibrioFischeriComprehensive Toxicity Method

LI Ru1,2,LU Nannan2,LI Mei1,SONG Wuchang2,SUN Shaohua2,JIA Ruibao2

(1.CollegeofEnvironmentalandMunicipalEngineering,ShandongJianzhuUniversity,Jinan250101,China；2.ShandongProvinceCityWaterSupplyandDrainageWater
QualityMonitoringCenter,Jinan250021,China)

This paper takes three common types of pollutants,namely heavy metals in water,pesticides and organic matter,as the research object,and applies the marine luminousVibrioFischerito the experiment study of the comprehensive toxicity of luminous bacteria.The result shows that by using freeze-dried powder rapid recovery technology for emergency monitoring,the contact time between bacteria and heavy metals,pesticides,poisonous and industrial organic pollutants is 10 min instead of the standard 15 min.Specific pollutants including heavy metals,agriculture chemicals and poisonous and harmful organics influence the bacteria light,and the light-limit rate increases with the concentration of pollutants.The influence of different pollutants is at different levels,which can realize the emergency monitoring of water quality by luminous bacteria comprehensive toxicity method.Key words:Vibriofischeri;comprehensive toxicity;light-limit rate;emergency monitoring technology for water quality;heavy metal;pesticide chemical;poisonous organic pollutant

1671-1556(2015)04-0104-06

2014-12-03

2015-05-08

山东省自然科学基金项目(ZR2014CP019)；国家水体污染控制与治理科技重大专项(2012ZX07404-003)；国家科技部项目(直饮水科技惠民示范工程)(2013GS370202)

李 汝(1989—)，女，硕士研究生，主要研究方向为饮用水安全。E-mail：liru01@yeah.net

X832

A

10.13578/j.cnki.issn.1671-1556.2015.04.018

贾瑞宝(1968—)，男，研究员，主要从事城市供水污染控制、供水应急处理等方面的研究。E-mail：jiaruibao68@126.com